Rapid detection of Streptococcus agalactiae using Strand Invasion Based Amplification (SIBA®) Method

Abstract

The aim of this Bachelor’s thesis was to develop a new and rapid method for the detection of Streptococcus agalactiae by using the isothermal SIBA®-method. S.agalactiae, i.e. group B streptococcus (GBS), is the leading cause of severe neonatal infections. In addition, it causes infections for pregnant women, the elderly and people, who have some chronic disease.

The experimental part of this thesis was executed at Orion Diagnostica’s Research and Development laboratory. The thesis was started by conducting oligoscreening to find the most suitable primer combinations. Along with the screening, GBS was grown on blood agar plate and LB broth. The genomic DNA was extracted from LB broth and quantified with qPCR. Primer combinations that passed the oligoscreening were tested with the genomic DNA. Suitable assays were optimized, the sensitivity and specificity of the assays were tested, and the best assay was freeze-dried. In addition, the effect of different lytic enzymes to SIBA® reaction and GBS cells was tested. Lastly, the developed SIBA GBS assay was tested with clinical samples by using freeze-dried reagents.

A rapid method for the detection of Streptococcus agalactiae was successfully developed during this thesis. With freeze-dried reagents, the assay detected GBS in 5.7 minutes at its best, when genomic DNA was used as a template. Clinical samples were tested with both qPCR and freeze-dried SIBA®-reagents, and in both tests 1/3 GBS positive samples was detected. Samples that were not detected could have been low positive samples, or the sample preparation method may not have been optimal.

On the basis of the results of this thesis, the assay could be further developed by optimizing the reaction conditions of freeze-drying. In addition, sample preparation methods should be developed further. Also, testing the sensitivity of the qPCR method and possible optimization of it should be done, since there was not enough time to do these during this thesis.

Tämän insinöörityön tavoitteena oli kehittää uusi ja nopea tapa Streptococcus agalacitaen tunnistamiseksi isotermaalista SIBA®- teknologiaa hyödyntäen. S.agalactiae eli B-ryhmän streptokokki (GBS) on beetahemolyytinen bakteeri, joka on merkittävä vastasyntyneiden infektioiden aiheuttaja. Lisäksi se voi aiheuttaa infektioita raskaana oleville naisille, vanhuksille sekä henkilöille, joilla on jokin perussairaus.

Tämän insinöörityön kokeellinen osuus suoritettiin Orion Diagnostica Oy:n tuotekehityslaboratoriossa. Työ aloitettiin oligoseulonnalla sopivan alukeparin löytämiseksi. Seulonnan ohella S.agalactiaea kasvatettiin verimaljalla ja LB-liemessä sekä pystytettiin kirjallisuuteen perustuva qPCR-menetelmä GBS:n tunnistamiseksi. LB-liemestä eristettiin genomista DNA:ta, joka kvantitoitiin qPCR:n avulla. Seulonnasta läpi päässeet alukeparit testattiin genomisella DNA:lla, ja jatkoon päässeet menetelmät optimoitiin. Optimoitujen menetelmien herkkyys ja spesifisyys testattiin sekä toimiva menetelmä kylmäkuivattiin. Lisäksi testattiin erilaisten lyysaysentsyymien vaikutusta SIBA®-reaktioon sekä entsyymien lyysaystehoa GBS-soluihin. Lopuksi menetelmää testattiin kliinisillä näytteillä kylmäkuivattuja reagensseja käyttäen.

Insinöörityön aikana onnistuttiin kehittämään nopea menetelmä S.agalactiaen tunnistamiseksi. Kylmäkuivatuilla reagensseilla menetelmä tunnisti GBS:n nopeimmillaan 5,7 minuutissa, kun templaattina käytettiin genomista DNA:ta. Kliiniset näytteet testattiin sekä qPCR:llä että kylmäkuivatuilla SIBA®-reagensseilla, ja molemmissa testeissä positiivisista näytteistä 1/3 detektoitui. Näytteet, jotka eivät detektoituneet, saattoivat olla heikkoja positiivisia tai käytetty näytteenkäsittelymenetelmä ei soveltunut testiasetelmaan.

Insinöörityön tulosten pohjalta menetelmän kehittämistä voi jatkaa kylmäkuivatun SIBA®-reaktion olosuhteiden optimoinnilla. Lisäksi näytteenkäsittelymenetelmiä tulee kehittää. Myös qPCR-menetelmän herkkyyden testaus ja mahdollinen optimointi olisi hyvä tehdä, sillä niitä ei ehditty tämän insinöörityön aikana suorittaa.