Construction of cloning vectors for Spo20 mediated membrane anchoring of hyaluronic acid metabolic pathway enzymes in Pichia pastoris

Abstract

This thesis was done in collaboration with VTT’s production host engineering research team, and it was part of the academy of Finland funded SynBioPol project. Aim of the SynBioPol project was to investigate different types of scaffolding or anchoring methods to improve the metabolic flux of the hyaluronic acid pathway

Hyaluronic acid is a high molecular weight polymer which consists of repeating units of disaccharides glucuronic acid and N-actylglycosamine linked by β1,3- and β1,4-glycosidic bonds. Hyaluronic acid is synthesized by the transmembrane protein hyaluronan synthase, which is a common enzyme in mammals and amphibians.

The aim of this thesis was to investigate whether or not the Saccharomyces cerevisiae sporulation specific protein 20 could be used as a membrane anchor to improve the metabolic flux of the hyaluronic acid metabolic pathway, by fixing the metabolic enzymes to cell membranes. The localization of the metabolic pathway enzymes was to be confirmed by creating a chimera protein with the sporulation specific protein 20 linked to one of the terminals of the metabolic enzyme and a fluorescent protein linked to the opposite terminal.

Due to time limitations not all goals set for this thesis were met and only the xhasA2 and xhasB genes were inserted into the expression vector pGAPZB. The correct cloning vectors were screened with colony PCR, restriction digestion analysis and finally sequenced to verify the composition of these cloning vectors. The correct cloning vectors were linearized with Bgl-II, transformed into Pichia pastoris with electroporation and then screened with colony PCR. On the basis of the colony PCR results, a handful of potential recombinant strains were produced.

Tämä insinöörityö tehtiin Teknologian tutkimuskeskuksen VTT Oy:n production host engineering -tutkimusryhmälle. Työ tehtiin osana Suomen Akatemian rahoittamaan SynBio-Pol-projektia, jonka tavoitteena on tutkia erilaisia skaffolding- ja ankkurointitekniikoita metaboliareittien, kuten, hyaluronihapon saantojen parantamiseksi.

Hyaluronihappo on molekyylipainoltaan suurin polymeeri, joka rakentuu glukuronihaposta ja N-asetyyliglukosamiinista, jotka ovat linkittyneet toisiinsa β1,3- ja β1,4-glykosidisidoksin. Hyaluronihappoa syntetisoi transmembraaniproteiini hyaluronihapposyntaasi. Hyaluroni-happosyntaasi on yleinen proteiini sekä nisäkkäiden että sammakkoeläimien solukalvoilla.

Tämän insinöörityön tarkoituksena oli tutkia, mikäli Saccharomyces cerevisiaen itiöinti-spesifistä proteiini 20:tä voitaisiin käyttää ankkuroimaan hyaluronihapon metaboliaentsyymejä solun kalvoille. Metaboliaentsyymien lokalisaatio solussa oli tarkoitus tarkistaa rakentamalla fuusioproteiini, jossa metaboliaentsyymin terminaaleihin olisi kiinnitetty itiöinti-spesifinen proteiini 20 ja vastakkaiseen terminaaliin fluoresoiva proteiini.

Tämä insinöörityö ei saavuttanut kaikkia sille asetettuja tavoitteita, ja vain ekspressiovektorit, johon geenit xhasA2 ja xhasB oli liitetty, ehdittiin rakentaa. Kloonatut plasmidit seulottiin pesäke-PCR:llä, jonka jälkeen niiden rakenne varmistettiin restriktioentsyymianalyysilla sekä sekvensoinnilla. Oikein rakentuneet vektorit linearisoitiin Bgl-II-entsyymillä, jonka jälkeen ne transformoitiin Pichia pastorikseen elektroporaatiolla. Transformantit seulottiin pesäke-PCR:llä, jonka avulla löydettiin muutama potentiaalinen rekombinantti Pichia pastoris -kanta.