Solunulkoisten vesikkelien lyofilisaatiokestävyys

Abstract

Opinnäytetyön tavoitteena oli selvittää solunulkoisten vesikkelien (engl. Extracellular Vesicles EV) lyofilisaatiokestävyyttä, vaikuttaako lyofilisaatio EV:den kykyyn kulkeutua solun sisään ja onko se haitallista soluille. EV:den merkitys korostuu niiden kykynä siirtää informaatiota solujen välillä vaikuttaen siten vastaanottavan solun ominaisuuksiin ja toimintaan. EV:den mahdollisuus olla apuna diagnostiikassa, soluterapiassa ja lääkeaineiden kuljettajina elimistössä on laajalti kasvavan kansainvälisen tutkimuksen kohteena. EV:t kestävät hyvin säilytystä alhaisissa lämpötiloissa (- 80 °C:ssa ja - 20 °C:ssa). Kylmäkuivattuja EV:tä olisi helppo kuljettaa ja varastoida joko huoneenlämmössä tai jääkaappiolosuhteissa. Näin säilytettynä EV:den käyttöikäkin pidentyisi. EV:n liuottaminen uudelleen käyttöönotettaessa olisi myös vaivatonta. EV:t voidaan jaotella kolmeen pääluokkaan niiden syntymekanismin perusteella: eksosomeihin, mikrovesikkeleihin ja apoptoottisiin vesikkeleihin.

Työssä käytettiin PNT2- ja PC3-solulinjan soluja sekä Suomen Punaisen Ristin Veripalvelusta saatua usean luovuttajan verihiutaleita sisältävää plasmaa, joista EV:t eristettiin ultrasentrifugoimalla. EV:t karakterisoitiin Western Blot -menetelmällä sekä mittaamalla näytteistä EV:den konsentraatio ja kokojakauma NTA-menetelmällä. Tämän jälkeen eri EV-näytteet lyofilisoitiin ja liuotettiin uudestaan näytteiksi, joiden EV-konsentraatio ja -kokojakauma määritettiin NTA-mittauksella. Tulosten saamiseksi EV:t leimattiin fluoresoivalla värillä ja laitettiin PC3-soluille soluun takaisinottoa varten. Lopuksi näytteet kuvattiin fluoresenssimikroskoopilla takaisinoton todentamiseksi. Työssä tarkasteltiin myös lyofilisoitujen EV:den vaikutusta solujen proliferaatioon.

Saaduista tuloksista huomattiin, että PC3-solut ottivat sisäänsä lyofilisoituja EV:tä heikommin kuin pakastettuja EV:tä. Lyofilisaatio ei muuttanut näytteen sisältämien mikrovesikkelien määrää suhteessa eksosomien määrään, mutta mikrovesikkelien kokojakauma vaihteli lyofilisoitujen EV:den ja pakastettujen EV:den keskuudessa. Proliferaatiokoe osoitti verihiutale-EV:den vauhdittavan PC3-solujen kasvua. Lyofilisoidut EV:t kiihdyttivät proliferaatiota eksponentiaalisen kasvuvaiheen loppupuolella enemmän kuin pakastetut EV:t. Tuloksista voidaan päätellä, etteivät lyofilisoidut EV:t ole haitallisia soluille ja ne säilyttävät toimintakykynsä. Ajatellessa EV:den lyofilisaatiokestävyyttä tarvitaan lisää tutkimuksia selvittämään eri alkuperästä eristettyjen EV:den kulkeutumista eri soluihin. Sen lisäksi tarvitaan standardoidut menetelmät EV:den eristykseen ja karakterisointiin.

The aim of the study was to find out the lyophilisation hardiness of extracellular vesicles (EV), whether lyophilized EVs have an ability to enter the cells and is it harmful to the cells. The importance of EVs is emphasized because of their ability to intercellular communication, thereby affecting the properties and operation of the receiving cell. EVs are emerging as potential biomarkers in various diseases. Also, international research is interested in increasing therapeutic opportunities of EVs including using them for drug delivery. The EVs are very resistant to storage at low temperatures (- 80 °C and - 20 °C). The lyophilized EVs would be easy to transport and store at room temperature or in refrigerator. Hence, the lifetime of EVs would extend. Also, rehydration would be easy to accomplish. EVs can be divided into three main categories based on their biogenesis: exosomes, microvesicles and apoptotic bodies.

The cells of the PNT2 and PC3 cell lines and multiple donor platelet-rich plasma (received from Finnish Red Cross) were used in this study. EVs were isolated by ultracentrifuge and characterized by the Western Blot method and measuring the EV concentration and size with Nanoparticle Tracking Analysis (NTA). Subsequently, the EV samples were lyophilized and redissolved to measure the concentration and size by NTA. EVs were labeled with fluorescent dye and placed on PC3 cells for uptake. The samples were photographed by a fluorescence microscope to verify the uptake. The effect of lyophilized EVs on cell proliferation was also studied.

From the results obtained, more frozen EVs than lyophilized EVs were uptaken by PC3 cells. Lyophilisation did not change the number of microvesicles contained in the sample in relation to the number of exosomes. Size distribution of the microvesicles varied between lyophilized EVs and frozen EVs, though. The proliferation test indicated that plasma EVs accelerate the growth of PC3 cells. Lyophilized EVs accelerated proliferation more than frozen EVs at the end of exponential phase. It can be concluded that the lyophilized EVs are not harmful to the cells and they preserve their functional capacity. In question of the lyophilisation hardiness of extracellular vesicles further studies are needed to examine the ways of uptake of different cell-derived EVs by different types of cells. In addition, standardized methods for EV isolation and characterization are needed.