CRISPR/Cas9-ohjattu Arabidopsis thalianan genomimuokkaus

Abstract

Kasvien geenimuuntelun turvallisuus jakaa mielipiteitä terveysvaikutustensa ja ympäristöriskiensä vuoksi. Aiemmin käytössä olleet geenimuuntelukeinot ovat osoittautuneet melko sattumanvaraisiksi, mutta CRISPR/Cas9-tekniikka voi tarkkuutensa ja nopeutensa ansiosta mullistaa koko kasvien geenimuuntelun. Siinä kasviin ei siirretä vieraita geenejä, vaan tarkoitus on muokata kasvin omia geenejä.

Opinnäytetyö tehtiin Helsingin yliopistolla Biotekniikan instituutissa. Työn tavoitteena oli CRISPR/Cas9-menetelmää käyttämällä muokata Arabidopsis thalianan eli lituruohon genomia aiheuttaen siihen mutaatio, jonka tyypistä ei etukäteen ollut varmuutta. Tarkoituksena oli, että koko kasvi – sekä lehdet että juuret – oli mutatoitunut. Tämä opinnäytetyö on osa isompaa tutkimuskokonaisuutta, jossa pyritään selvittämään transkriptiofaktorin X tehtävä. Hypoteesi on, että kyseinen transkriptiofaktori säätelee solunjakautumista tietyissä soluissa.

CRISPR-nimitys tulee englanninkielisistä sanoista Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, mikä tarkoittaa bakteerien DNA-segmenttejä, jotka koostuvat lyhyistä, toistuvista emäsjaksoista ja niiden välissä sijaitsevista lyhyistä DNA-välikappaleista. CRISPR on tärkeä osa monien bakteerien ja useimpien arkkien immuunijärjestelmää, jonka avulla ne puolustautuvat virusten hyökkäyksiä vastaan. Cas on CRISPR:iin liittyvä endonukleaasientsyymi, jolla on kyky katkaista DNA-molekyyli.

Työ toteutettiin osittain kasvihuoneella ja osittain laboratoriossa. Kasvihuoneella istutettiin valokaapissa MS-maljalla etukäteen kasvatetut kasvit multaan ja annettiin niiden kasvaa muutaman viikon ajan. Laboratoriossa valmistettiin CRISPR-konstrukti PCR-reaktioiden, digestioiden sekä ligaation avulla. Transformaatiot sekä Escherichia coli -bakteeriin että agrobakteeriin tehtiin elektroporaatiolla. Transformaatio Arabidopsis thalianaan tehtiin in planta -menetelmällä agrobakteerivälitteisesti dippaamalla.

CRISPR-konstruktin tekeminen ja transformaatiot sekä E. coliin että agrobakteeriin onnistuivat. Kasvihuoneella kasvit saatiin kasvamaan ja tuottamaan kukkia. Ligaatioreaktio osoittautui erittäin vaikeaksi ja vaatii vielä paljon optimointia, jotta transformaatiotehokkuus ja siten koko työn onnistumisprosentti paranee. Ajanpuutteen vuoksi jäi selvittämättä, oliko CRISPR/Cas9-mutantteja syntynyt ja minkä tyyppisistä mutaatioista oli kysymys.

Safety of the genetic modification of plants divides opinions about health effects and risks for the environment. Genetic modification methods used in the past have proved to work in a haphazard manner. Due to its accuracy and rapidity, CRISPR/Cas9-method can revolutionize the genetic modification of plants. In this method, foreign genes are not transferred to the plant but the aim is to modify plant's own genes.

This study was made at the Institute of Biotechnology at the University of Helsinki. The aim was to modify the genome of Arabidopsis thaliana by the CRISPR/Cas9-method and thus cause a mutation, the type of which was not certain in advance. The aim was that the entire plant – both the leaves and the roots – had mutated. This study is part of a larger study to determine the function of transcription factor X. The hypothesis is that this transcription factor regulates cell division in certain cells.

The term CRISPR is an abbreviation for Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, meaning bacterial DNA segments consisting of short, repetitive base sequences and short DNA spacers between them. CRISPR is an essential part of the immune system of many bacteria and most of the archaea, which these use to protect against viral attacks. Cas is a CRISPR-associated endonuclease enzyme which can cut the DNA molecule.

The work was carried out partly in a greenhouse and partly in a laboratory. Plants, which were grown in MS-medium plates in the light cabinet in advance, were planted to soil in the greenhouse and allowed to grow for a few weeks. The CRISPR-construct was made in the laboratory with PCR-reactions, restrictions and ligation. The transformations to both Escherichia coli and agrobacterium were made by electroporation. The transformation to Arabidopsis thaliana was made in planta by agrobacterium-mediated floral dip -method.

Making the CRISPR-construct and transformations to both E. coli and agrobacterium were successful. Plants were grown and produced flowers in a greenhouse. The ligation reaction proved to be very difficult and requires much optimization to increase the transformation efficiency and in that way the success rate of entire work. Due to lack of time, it remained unclear whether the plants were mutated and what types of CRISPR/Cas9-mutations had been formed.