The Overexpression, Purification and Characterization of FhuA, pb5 and VHH Antibodies, and Complex Formation for Crystallization Screening

Abstract

Membrane proteins induce the required communication between the cell and the surrounding environment, therefore they can act as transporter proteins. They can be used by different pathogens, such as bacteriophages, among which we find T5, in the process of an infection. Through its RBP, it has the ability to infect E. coli with great specificity, using one of the bacteria’s transporters to recognize and bind to the cell. In this study, the proteins FhuA and pb5 were targeted with the purpose of characterizing a membrane protein complex, formed by a) the bacterial ferrichrome transporter ‘FhuA’, pre-sent in E. coli bacterial outer membrane and b) the bacteriophage T5’s viral tail tip protein ‘pb5’. VHH antibodies were also used in order to optimize the crystallization between FhuA and pb5 by increasing the soluble surface of the complex. A process of overexpression in E. coli cells and later purification using different chromatographic methods were performed, followed by crystallization, either by hand in the laboratory or in an HTX platform. As a result, various steps of the different methods were improved, extra information on the handling of the different proteins was provided and several crystals were obtained successfully. These crystals will be used for X-ray crystallography and if they possess the expected quality, the FhuA-pb5 complex’s 3D structure could be obtained. Further studies are still needed to solve this structure, in order to enlighten the phage T5’s infection process and interaction with the transporter. The project was carried out in Grenoble, France, in the Institut Biologie Structurale (IBS) research center in the group of Membranes and Pathogens (M&P).

Membraaniproteiinit mahdollistavat tarvittavan viestinnän solun ja sen ympäristön välillä, jonka vuoksi ne voivat toimia muun muassa kuljettajaproteiineina. Niitä voi kuitenkin käyttää hyväkseen myös erilaiset patogeenit infektioprosesseissaan, kuten bakteriofaagit, joista eräänä myös T5.Se käyttää reseptoriin sitoutuvaa spesifistä proteiiniaan E.colin infektoimiseen, käyttäen bakteerin kuljettajaproteiinia solun kiinnittymiseen ja tunnistamiseen. Kyseisessä tutkimuksessa keskityttiin kahteen proteiiniin, tarkoituksena proteiinikompleksin tutkiminen, muodostuen a) E. colin ferrikromikuljettajaproteiini “FhuA:sta”, esiintyen bakteerin solukalvolla ja b) bakteriofaagin häntäproteiinin ”pb5:stä”: Myös VHH antibodeja käytettiin FhuA:n ja pb5:n kristallisoimisen optimoimiseksi, joiden tarkoituksena oli lisätä kompleksin liukoisuutta. Tekniikkoina käytettiin ekspressiota E.coli -soluissa ja erilaisia kromatografisia puhdistusmenetelmiä, jonka jälkeen kristallisaatio suoritettiin, joko käsin pipetoimalla, tai ulkoisen HTX laboratorion avulla. Tuloksena saavutettiin usean työvaiheen optimointi, lisäinformaation saavuttaminen proteiinien käsittelystä, sekä usean kristallin muodostuminen, joita voidaan jatkossa käyttää röntgensädekristallografiassa, jos niiden laatu täyttää vaatimukset. Tällöin voitaisiin saavuttaa FhuA-pb5 proteiinikompleksin kolmiulotteinen rakenne, mikä avaisi faagin infektioprosessia ja vuorovaikutusta kuljettajaproteiinin kanssa. Projekti suoritettiin Grenoblessa, Ranskassa, IBS -tutkimuskeskuksessa (Institut Biologie Structurale), tutkimusryhmässä nimeltä Membraanit ja Patogeenit (M&P).