Oksisteroleita sitovan proteiinin kaltainen proteiini 2:n (ORP2) hiljentämisen vaikutus maksasolujen rasva-aineenvaihduntaan

Abstract

ORP2 on oksisteroleita sitovan proteiinin (OBSP) kaltainen, proteiini 2. Nisäkkäillä ORP perheen proteiinit ovat solun sisällä vaikuttavia proteiineja, joista joidenkin on havaittu liittyvän rasva-aineenvaihduntaan. Ateroskleroosi eli valtimokovettumatauti on yhä lisääntyvä ongelma länsimaisessa kulttuurissa ja siihen liittyy oleellisesti rasva-aineenvaihduntahäiriöt, jotka aiheutuvat erityisesti rasvaisen ja sokeripitoisten ruokien kulutuksesta, monista huonoista elämäntavoista, kuten vähäisestä liikunnasta, tupakoinnista jne.

Opinnäytetyömme keskittyi ORP2 merkityksen selvittämiseen humaani HUH7-maksasoluviljelmässä tutkimalla OSBPL2-geenin hiljentämisen vaikutusta rasva-aineenvaihduntaan. Neljää eri solulinjaa käytettiin työssä: HUH7 kontrollisoluja, HUH7 Cas9 kontrollisoluja ja kahta tiettyä ORP2 hiljennettyä solulinjaa käyttäen CRISPR-Cas9 geenihiljennysmenetelmää.

Analysoimme solujen erittämiä apolipoproteiineja ja rasvoja soluviljelyliuoksesta käyttäen ELISA-määrityksiä ja muita entsymaattisia fotometrisiä menetelmiä. Mitattavat rasvat olivat kolesteroli, triglyseridi ja fosfolipidit. Apolipoproteiineista määritimme apoB-100- ja apoA-I-pitoisuudet. Solun erittämien lipoproteiinien kokoanalyysiin käytettiin korkean erotuskyvyn nestekromatografiaa eli FPLC-menetelmää.

Työssä havaittiin, että ORP2-hiljennetyt solut erittivät enemmän apoB-100:aa ja triglyseridejä soluviljelyliuokseen kontrollisoluihin verrattuna. Nämä muutokset johtuvat joko lisääntyneestä VLDL/apoB-100 tuotannosta tai esiasteella olevan VLDL:n eritysreitin aktivoitumisesta. Solun sisäistä tuotantoa ja kuljetusreittiä tarkastelemalla lisätutkimuksin, päästäisiin lähemmäksi varsinaista ORP2-välitteistä mekanismia. ApoA-I:n, HDL:n tärkeimmän apolipoproteiinin eristyksessä ei ollut merkittäviä eroja solulinjojen välillä. Tämän työn perusteella osoittautui, että ORP2:n hiljentäminen maksasoluissa lisää yhden valtimokovettumataudin riskitekijän apoB-100:n erittymistä sekä myös triglyseridien määrää. Tämä työ mahdollistaa tarkempien jatkotutkimusten tässä työssä saatujen tulosten vahvistamiseksi. Opinnäytetyö tehtiin Lääketieteellisen tutkimuslaitos Minervan laboratoriossa Biomedicum 2U tiloissa Helsingissä yhteistyössä dosentti Matti Jauhiaisen ja professori Vesa Olkkosen kanssa. Erityiset kiitokset maisteri Jari Metsolle.

ORP2 is defined as an oxysterol binding protein (OSBP) related protein 2. The whole family of mammalian related ORPs has been investigated during the past two decades and many of the family member proteins have been found to associate with regulation of the lipid metabolism. Atherosclerosis and atherosclerotic cardiovascular diseases (ACVD) are the leading cause of mortality and morbidity in industrialized western societies. There are a multitude of risk factors behind these pathologies including high fat and sugar containing nutrition, sedentary life style, smoking etc.

The main focus in the present work was to examine the effect of ORP2 silencing on hepatocyte lipid metabolism. Four different cell types were used for the experiments: wild type HUH7 cells, control group of HUH7-Cas9 cells and two HUH7 cell cultures in which the OSBPL2-gene was silenced using CRISPR-Cas9 silencing method. Secreted lipoproteins from the hepatocytes were analyzed using FPLC chromatography.

We analyzed apolipoproteins apoB-100 and apoA-I with ELISA and the secreted cholesterol, triglycerides and choline-containing phospholipids with enzymatic photometric methods. A significant increase in apoB-100 concentration in the cell medium of ORP2 silenced cells was observed compared to control HUH7-Cas9 cells. A significant increase in triglyceride levels was also observed in silenced cells suggesting elevated secretion of nascent VLDL particles. No significant differences were observed in apoA-I secretion between ORP2 silenced and control cells. The present work suggests that ORP2 silencing enhances secretion of atherogenic apoB-100 containing particles as well as triglycerides into cell medium. Future work is necessary to pinpoint the role of ORP2 in the biosynthesis/secretory pathway of apolipoprotein B-100. This work was done in the laboratory of Minerva Foundation Institute for Medical Research at Biomedicum 2U building in Helsinki co-operating with adj. prof. Matti Jauhiainen and professor Vesa Olkkonen. Special thanks to M.Sc Jari Metso.