Virtaussytometrian testaus GLUT4-translokaation tutkimisessa ja metodissa käytettävien vasta-aineiden validointi

Abstract

Opinnäytetyön tarkoituksena oli testata virtaussytometrian toimivuutta GLUT4-proteiinin translokaation tutkimisessa sekä validoida menetelmässä käytettyjä vasta-aineita. Työ toteutettiin yhteistyössä Lääketieteellisen tutkimuslaitos Minervan kanssa. Tavoitteena oli selvittää, voitaisiinko virtaussytometriaa menetelmänä käyttää tyypin 2 diabetekselle altistavan suomalaisspesifisen AKT2-geenivariantin tutkimisessa. AKT2-geenivariantti liittyy heikentyneeseen insuliinin signaalinsiirtoon, mikä mahdollisesti vaikuttaa GLUT4-glukoositransportterin toimintaan.

GLUT4-glukoositransportteri on normaalitilassa solunsisäisinä rakkuloina, mutta siirtyy insuliinin vaikutuksesta nopeasti solukalvolle. Tämä insuliinin stimuloima glukoosin kuljetus lihassoluihin on keskeinen tekijä veren glukoosipitoisuuden säätelyssä. Tyypin 2 diabeteksessa insuliinin signaalireitissä esiintyy kuitenkin poikkeamia, jotka heikentävät GLUT4-transportterin siirtymistä solukalvolle ja glukoosin kuljetusta soluun.

Koehenkilöiltä oli aikaisemman tutkimuksen yhteydessä kerätty biopsianäytteitä reiden vastus lateralis-lihaksesta. Näistä näytteistä oli luotu primaariset soluviljelmät, joita tässä opinnäytetyössä käytettiin virtaussytometrian testaamiseen, sekä vasta-aineiden validointiin western blotilla ja immunofluoresenssivärjäyksillä.

Virtaussytometriaa lähdettiin testaamaan aiemman julkaisun pohjalta, mutta sitä ei saatu toimimaan odotetulla tavalla. Parhaat tulokset menetelmässä saatiin käyttämällä Santa Cruzin vasta-ainetta. Kaksi muuta testauksen kohteena ollutta vasta-ainetta eivät antaneet menetelmässä järkeviä tuloksia. Myös vasta-aineiden validoinnissa Santa Cruzin vasta-aine osoittautui toimivimmaksi. Virtaussytometrian toimivuus GLUT4-translokaation tutkimisessa jäi vielä epäselväksi ja tulevaisuudessa menetelmän optimointia tulisi jatkaa selvittämällä optimaalinen vasta-ainepitoisuus titraamalla, sekä käyttämällä täysin negatiivisia, GLUT4:ä sisältämättömiä kontrollisoluja.

The purpose of this study was to test flow cytometry for studying GLUT4 translocation and validate antibodies used in the method. This study was carried out at Minerva Foundation Institute for Medical Research, Helsinki, Finland. The aim was to find out if flow cytometry method could be used to study AKT2 gene variant enriched in the Finnish population. AKT2 variant is associated with type 2 diabetes and impaired insulin signaling, which may affect the function of GLUT4 glucose transporter protein. GLUT4 glucose transporter plays a key role in regulating whole body glucose homeostasis.

Muscle cell biopsies had been collected from the test subjects before the beginning of this study. Primary cell cultures were created from the samples and used in this study to test flow cytometry and to validate three different antibodies with western blot and immunofluorescence staining.

Testing of flow cytometry was based on a previous study, however the method did not work as anticipated. The best results were obtained with Santa Cruz antibody. Other antibodies did not give sensible results in this method. Validation of the antibodies also showed Santa Cruz to be the most specific out of the tested antibodies. The functionality of flow cytometry for studying GLUT4 translocation was left questionable. In the future the optimization of the method should be continued by titrating the antibodies and using GLUT4 negative control cells.