Sandwich Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Optimization and Validation for Ricin Protein

Abstract

Ricin is listed in the Chemical Weapons Convention (CWC) as a schedule 1 toxic chemical with no known antidote and threat of terrorism due to its toxic nature. Because of the potential misuse, a method for precise detection of ricin is crucial. In this study enzymatic ricin detection method, Sandwich Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (sandwich ELISA), was optimized and validated for the Finnish Institute for Verification of the Chemical Weapons Convention (VERIFIN).

Sandwich ELISA method optimization is focused on antibody biotinylation, multiple buffer solutions, antibody concentrations and conjugate enzyme concentration. Antibody and conjugate enzyme concentrations were determined using titration and concentrations where ideal signal-to-noise ratio were chosen. Validation focused on limit of blank (LOB), limit of detection (LOD), intra- and inter-assay precision, recovery and specificity. LOB, LOD and assay precisions were determined from multiple ELISA results. Recovery of the ELISA method was tested using three matrices: milk, red wine and wheat flour. Specificity was tested using two ricin like proteins agglutinin and abrin.

Method optimization was successful detecting ricin in 0.03 % BSA 0.1 % TritonX in PBS solution comfortably down to 7.6 pg/ml. Optimized concentrations for antibodies were for coating 2.5 µg/ml, detection 0.8 µg/ml and conjugate enzyme was optimized to 1 ng/ml. LOB was 2.4 pg/ml and LOD was 2.9 pg/ml. Intra-assay precision was lowest at 3.9 % and highest at 105 %, inter-assay precision low was 14 % and a high of 35 %. Sample matrices disturbed the ricin ELISA determination and recovery from three matrices were low. No cross reactivity for abrin was found. However, agglutinin from 25 ng/ml onwards was detected.

Sandwich ELISA for ricin works well when using optimized sample matrix, 0.03 % BSA 0.1 % TritonX in PBS, but the other three matrices had substantial effect on the assay and ricin detection. Validation results suggest that the assay has still a lot to be improve upon.

Risiini kuuluu Kemiallisen aseen kieltosopimuksen (CWC) listan 1 kemikaaleihin. Sille ei ole tunnettua vastalääkettä ja se on myös terrorismiriski myrkyllisyytensä vuoksi. Mahdollisen väärinkäytön uhan vuoksi on tärkeää, että risiinille on tarkka havainnointimenetelmä. Tässä opinnäytetyössä optimoitiin ja validoitiin entsymaattinen risiinin määritysmenetelmä, kerrosmainen entsyymivälitteinen immunosorbenttimääritys (kerros ELISA) Kemiallisen aseen kieltosopimuksen instituutille (VERIFIN).

Kerros ELISA -menetelmän optimointi keskittyi vasta-aineiden biotinylointiin, puskuriliuoksiin, vasta-ainekonsentraatioihin ja entsyymikonjugaatin konsentraatioon. Vasta-aine- ja entsyymikonjugaatin konsentraatiot määritettiin titraamalla ja parhaat konsentraatiot valittiin signaali-kohinasuhteen perusteella. Validointi keskittyi nollarajan (LOB), toteamisrajan (LOD), sisäisen analyysin ja analyysien väliseen tarkkuuteen, saantoon ja spesifisyyteen. LOB:n, LOD:n ja analyysin tarkkuuden tulokset määritettiin useasta ELISA-tuloksesta. Saantokokeissa testattiin ELISA-menetelmää kolmella eri näytematriisilla: maidolla, punaviinillä ja vehnäjauhoilla. Menetelmän spesifisyys testattiin käyttämällä kahta risiinin kaltaista proteiinia, agglutiniinia ja abriinia.

Menetelmän optimointi onnistui ja menetelmällä pystyttiin havaitsemaan vaivattomasti risiinikonsentraatiot 0,03 % BSA ja 0,1 % TritonX PBS liuoksessa 7,6 pg/ml asti. Vasta-aineiden optimoidut konsentraatiot olivat päällystykseen 2,5 µg/ml ja havainnointiin 0,8 µg/ml. Entsyymikonjugaatille optimoitiin 1 ng/ml pitoisuus. LOB oli 2,4 pg/ml ja LOD oli 2,9 pg/ml. Sisäisen analyysin tarkkuus vaihteli 3,9 % ja 105 % välillä. Analyysien välinen tarkkuus vaihteli 14 % ja 35 % välillä. Näytematriisit haittasivat risiini ELISAa, ja näiden osalta saannot jäivät alhaisiksi. Risiini ELISA ristireagoi agglutiniinin kanssa, kun agglutiniinia oli näytteessä 25 pg/ml. Abriini ei sitoutunut käytettyihin risiinivasta-aineisiin.

Kerros ELISA risiinille toimi hyvin, kun käytössä oli optimoitu näyte matriisi, 0,03 % BSA ja 0,1 % TritonX PBS:sä, mutta käytettäessä kolmea testattua matriisia oli niillä huomattava vaikutus analyysiin ja risiinin havainnointiin. Validointitulokset osoittavat, että menetelmässä on vielä useita osa-alueita joita tulisi kehittää.