DNA-eristysmenetelmien vertailu MRSA:n ja MRSP:n tunnistamiseen multiplex qPCR -tekniikalla

Abstract

Resistentit stafylokokkibakteerit, metisilliinille resistentit Staphylococcus aureus (MRSA) ja Staphylococcus pseudintermedius (MRSP), ovat yleistyneet taudinaiheuttajina eläimillä. Kyseisten bakteerien kantajia etsitään laboratorioissa biokemiallisia tunnistusmenetelmiä käyttäen, jonka lisäksi positiiviset ja epävarmat tulokset varmistetaan usein PCR-menetelmän avulla.

Opinnäytetyön tavoitteena oli löytää Helsingin yliopiston eläinlääketieteellisen tiedekunnan kliinisen hevos- ja pieneläinlääketieteen osaston mikrobiologian laboratorion käyttöön so-piva DNA-eristysmenetelmä. Menetelmällä MRSP/A-seulontanäytteiden rikastusliemestä eristettyä DNA:ta käytettäisiin MRSA:n ja MRSP:n tunnistamiseen suunnitellussa multiplex qPCR-testissä, jonka geenikohteina ovat S. aureus nuc, S. pseudintermedius nuc, sekä mecA- ja mecC-geeni. Menetelmän tuli olla mahdollisimman yksinkertainen, edullinen ja vähiten työntekijän aika kuluttava, mutta kuitenkin tarpeeksi herkkä ja luotettava.

Menetelmiä vertailtiin ensisijaisesti jo aikaisemmin laboratoriossa käytössä olleeseen PCR-reaktioita inhiboivia aineita sitovaan resiinipohjaiseen menetelmään, joka sisälsi näytteen sentrifugointia, pesua, resuspensointia ja inkubointia. Tätä liian työlästä ja hidasta menetelmää muunnettiin kolmeksi erilaiseksi menetelmäksi, joissa oli vähennetty pesu- ja sentrifugointivaiheita tai lyhennetty inkubaatioaikaa. Lisäksi testattiin Nordiag Arrow -eristysautomaatin Bugs N’ Beads -kittiä. Eri menetelmillä eristettyjä DNA-näytteitä vertailtiin mittaamalla niiden DNA-konsentraatioita NanoDrop-spektrofotometrillä sekä ajamalla ne in-house multiplex qPCR:llä. Testejä tehtiin kolmella tunnetulla bakteerikannalla sekä näiden seoksella, jonka jälkeen simuloiduilla potilasnäytteillä ja 39 varsinaisella, jo kliinisesti tutkitulla näytteellä.

Vertailun perusteella käyttöön saatiin manuaalinen menetelmä, johon ei kuulunut alkupe-räisen menetelmän pesuvaihetta ja jonka inkubointivaiheet olivat nopeammat. Eris-tysautomaatilla eristetty DNA ei eronnut huomattavasti laboratoriolle halvemmalla mene-telmällä eristetystä DNA:sta. Kaikkein nopeimmalla ja halvimmalla menetelmällä eristetyn DNA:n konsentraatio oli liian alhainen heikentäen menetelmän herkkyyttä.

Methicillin resistant staphylococci, Staphylococcus aureus (MRSA) and S. pseudintermedius (MRSP), have become a real problem as pathogens in animals. In la-boratories, carriers are identified by using biochemical tests. Positive and uncertain results are usually verified with PCR, which detects the genes in the bacteria that cause methicil-lin-resistance.

The purpose of this Bachelor’s study was to discover a suitable DNA isolation method for the Clinical microbiology laboratory of the Faculty of Veterinary Medicine, University of Helsinki. The method would be used to identify MRSA and MRSP with multiplex qPCR technique, in which target genes were S. aureus nuc, S. pseudintermedius nuc, mecA-gene and mecC-gene. The new method would have to be as affordable and rapid for an employee as possible, but at the same time sensitive and reliable enough.

Three different methods were compared to the resin-based original method, which included centrifugation, washing, resuspensions and incubations. The alternative methods were simplified variations of the original method by cutting the steps and reducing the incubation times of the isolation. In addition of these methods, an automatic isolation, Nordiag Arrow -instrument and Bugs N’ Beads -kit, was tested. Isolated DNA was analyzed by measuring the DNA concentration and purity with a NanoDrop spectrophotometer, and using the in-house multiplex qPCR. At first, three different bacterial control strains and a mixture of them were used, followed by simulated specimens and 39 genuine, clinically tested patent specimens in enrichment broth.

As a result a the method, which will be used in the future, was discovered. The method does not include any wash steps and the incubation times are lower than in the original method. The DNA isolated with the automatic instrument did not significantly differ com-pared to the DNA isolated with the manual methods. The DNA yield of the fastest and most affordable extraction method was so low, that it affected the sensitivity of the method.