Synteettisten kortikosteroidien määritys maidosta LC-MS/MS-tekniikalla sekä menetelmän kehitys ja validointi

Abstract

Opinnäytetyöhön liittyvät laboratoriotyöt suoritettiin Elintarviketurvallisuusvirasto Eviran Kemian tutkimusyksikön Vierasaineet ja jäämät -jaostossa Helsingin toimipisteessä.

Opinnäytetyön tarkoituksena oli kehittää sekä validoida uusi talonsisäinen menetelmä synteettisten kortikosteroidien määrittämiseen lehmänmaidosta käyttäen nestekromatografiaa yhdistettynä tandemmassaspektrometriaan (LC-MS/MS). Tutkittavina yhdisteinä olivat beetametasoni, deksametasoni, prednisoloni sekä metyyliprednisoloni.

Menetelmänkehitys aloitettiin tutustumalla tieteellisiin artikkeleihin sekä valitsemalla niiden joukosta yksi talonsisäisen menetelmän esikäsittelyn kehittämisen pohjaksi. Valittu menetelmä (Tölgyesi et al., 2010) perustui nopeaan maidon esikäsittelyyn käyttäen pääpuhdistusvaiheena vahvaa kationinvaihto-kiinteäfaasiuuttoa. Kehitettävän menetelmän sisäisenä standardina käytettiin 17β-testosteroni-d3-yhdistettä. Artikkelin esikäsittelyä muutettiin omiin tarpeisiin sekä välineistöön sopivammaksi. Tutkittaville yhdisteille luotiin myös uusi kromatografia-massaspektrometria-ohjelma, johon valittiin tutkittavien kortikosteroidien seurattavat prekursori- sekä tuoteionit. Myös sopiva gradienttiohjelma kehitettiin kokeilujen tuloksena. Kahta sidosryhmiltään erilaista nestekromatografian kolonnia kokeiltiin kehitysvaiheessa. Massaspektrometrian ionisointitekniikkana käytettiin sähkösumutusionisaatiota. Kokeilumittaukset suoritettiin ennen validoinnin aloittamista. Validointi suoritettiin Eviran validointiohjeen mukaisesti sekä ottamalla erityisesti huomioon Euroopan Unionin Komission päätös 2002/657/EY.

Validointi onnistui hyvin. Lisäystasojen 0,5 MRL, 1,0 MRL sekä 1,5 MRL saantoprosenttien arvoiksi saatiin 104,8–114,7 %. Keskihajonnan arvot (sd) olivat beeta- sekä deksametasonille 0,01–0,04 µg/kg, prednisolonille 0,31–0,073 µg/kg sekä metyyliprednisolonille 0,23–0,68 µg/kg. Menetelmän toistettavuus ja laboratorion sisäinen uusittavuus olivat näin ollen hyviä. Nollanäytteissä ei kromatogrammien mukaan havaittu ollenkaan tutkittavia kortikosteroideja, mikä indikoi menetelmän korkeaa spesifisyyttä ja häiritsevien yhdisteiden vähyyttä. Vertailu-näytteiden tulosten mukaan menetelmän oikeellisuus oli korkea. Päätösrajan arvot CCα olivat välillä 0,37–7,87 µg/kg ja osoituskyvyn arvot CCβ 0,42–8,72 µg/kg. Regressioanalyysin mukaan valittu mittausalue oli lineaarinen residuaalien ollessa satunnaisesti molemmin puolin nollatasoa. Säilyvyyskokeiden perusteella esikäsitellyt maitonäytteet säilyivät juurikaan muuttumatta kolmenkin viikon pakastusajan. Menetelmä täytti näin ollen sille asetetut tavoitteet ja se tullaan ottamaan lähiaikoina rutiinikäyttöön Evirassa.

The laboratory work related to this study were performed at the Contaminants and Residues laboratory in the unit of Chemistry, at Finnish Food Safety Authority Evira in Helsinki.

The purpose of this study was to develop and validate a new in-house method for the Determination of synthetic corticosteroids from bovine milk using liquid chromatography-tandem mass spectrometry. The compounds of interest in this validation were betamethasone, dexamethasone, prednisolone and methylprednisolone.

The method development was initiated by exploring the scientific articles and selecting one suitable article as the basis for the pretreatment of the in-house method development. The selected article (Tölgyesi et al., 2010) was based on the rapid pretreatment of the milk matrix using strong cation-exchange solid-phase extraction (SPE) as the main purification procedure. The 17β-testosterone-d3 was used as the internal standard (ISTD). The pretreatment of the selected article information was converted to comport with the necessity and the equipment available. The new chromatography-mass spectrometry program was generated with the monitored precursor and product ions. The appropriate gradient program was generated in consequence of multiple tests as well. Two different chromatography columns with different stationary particles were explored during the test period. The electrospray ionization (ESI) was utilized as the ionization method in mass spectrometry. The test measurements were performed prior to the validation procedure. The validation was carried out according to the validation instruction of the Finnish Food Safety Authority Evira and the European Union Commission Regulation 2002/657/EY.

The validation was performed successfully. The percent recovery values of the validation levels 0.5 MRL, 1.0 MRL and 1.5 MRL were at the range of 104.8–114.7 %. The standard deviation values were 0.01–0.04 µg/kg for betamethasone and dexamethasone, 0.31–0.073 µg/kg for prednisolone and 0.23–0.68 µg/kg for methylprednisolone. However, the repeatability of the method was high-quality. All the spiked blank samples were clean and indicated merely trifle distracting factors and high specificity. According to the results of the certified reference material, the trueness of the method was high, especially for both methasone compounds. The CCα values were 0.37–7.87 µg/kg and CCβ 0.42–8.72 µg/kg. The regression analysis represented linearity of the measurement area while the residuals were randomly at the both sides of the zero level. The preservation tests of the pretreated milk samples demonstrated even three weeks’ moderate preservation at freezing. The validated new in-house method achieved the requirements presented and it will be applied in routine analysis at Evira.