T-Cell Xtend -reagenssin testaus pitkittyneessä T-SPOT.TB-näytekuljetuksessa

Abstract

Latentin tuberkuloosin tutkimiseen käytettävää diagnostista in vitro ELISPOT-testiä varten otetun kokoverinäytteen lyhyt säilyvyysaika on ollut esteenä määrityksen laajemmalle käytölle, sillä näytteen käsittely tulee aloittaa neljän tunnin sisällä näytteenotosta. T-Cell Xtend -reagenssia markkinoidaan keinona pidentää näytteen kuljetusaikaa. Tämän työn tarkoituksena oli selvittää, miten näytteen 24 tunnin säilytys vaikuttaa ELISPOT-menetelmään perustuvan T-SPOT.TB -testin tarkkuuteen. Säilytyksen vaikutusta testattiin Vacutainer® CPT™ -putkessa (Cell Preparate Tube) sekä BD Vacutainer® litiumhepariiniputkessa, johon oli lisätty T-Cell Xtend -liuosta. Työssä arvioitiin T-Cell Xtend -liuoksen ja CPT-putken valmistajien antamat suositukset näytteen säilyvyydestä.

Tulokset osoittivat, että verinäytteen säilytys 24 tuntia vaikutti T-SPOT.TB -määrityksen tarkkuuteen. T-Cell Xtend -liuoksen lisääminen ei selvästi parantanut vuorokauden kuluttua näytteenotosta analysoitujen näytteiden säilyvyyttä, vaan saadut spottimäärät olivat alhaisempia kuin heti näytteenoton jälkeen analysoidusta litiumhepariiniputkesta saadut spottimäärät. Näytteen säilytys CPT-putkessa 24 tuntia aiheutti myös spottimäärien laskua. Näytteen viivästynyt käsittely lisää riskiä, että reaktiivisten solujen frekvenssit ovat alhaisemmat kuin alle neljässä tunnissa käsitellyssä näytteessä.

To diagnose latent tuberculosis infection (LTBI) new immunodiagnostic tests based on release of interferon gamma upon ex vivo stimulation with TB specific antigens (IGRA) have been recently introduced. One of the IGRAs is an ELISPOT- based commercial T-SPOT.TB assay (Oxford Immunotec). The availability of fresh samples with viable lymphocytes is the major concern to ensure accurate results. It is recommended that the samples should be analyzed within 4 hours from the venipuncture. To extend the storage of samples, a commercial reagent T-Cell Xtend was developed (Oxford Immunotec). The aim of this study was to evaluate T-Cell Xtend for prolonged sample storage and to compare the results to those obtained within 4 hours.

The tested reagent was added to lithium heparin tubes 24 hours after the blood samples were preserved in a vertical position at room temperature. For the controls was used the same samples drawn in the same tube and into the Cell Preparation Tube (CPT) (Becton, Dickinson and Company) which were analyzed immediately. The stability of lymphocytes was checked from CTP tubes that were analyzed with a 24-hour delay. The purity of the lymphocyte fraction after centrifugation from each of the tested tubes was also compared.

The addition of the T-Cell Xtend reagent after 24 hour storage did not preserve the frequencies of reactive lymphocytes on the same level as the samples that were processed immediately. The T-Cell Xtend reagent improved the separation of peripheral blood mononuclear cells from the whole blood but the observed immunological reactivities were lower compared to the samples processed immediately. We conclude that the delay in the processing of samples will result in suboptimal performance that cannot be compensated with the addition of the T-Cell Xtend. For the ELISPOT-based assays the samples should be processed within a 4-hour timeframe. However, if the delay is inevitable the borderline results should be interpreted with caution.