Optimizing the Bacterial Expression and Purification of Phactr4 Protein and its Fragments

Abstract

This final project was carried out in co-operation with a research group led by Maria Vartiainen Ph.D at the Helsinki Institute of Biotechnology. The aims of this work were: 1. Cloning Phactr4 protein’s fragment Ph4 1-528 into bacterial expression vector pET41a producing a GST-tag, 2. Optimizing the expression of Phactr4 fusion protein and its C-terminal and N-terminal fragments consisting of optimizing temperature, time and testing the solubility of the fusion proteins and 3. Optimizing the purification of the two fragments of Phactr4 protein.

The cloning process was successfully performed after some optimization and change of vector. The optimal combination of temperature and time for expressing the fusion proteins was +37oC for duration of three hours. The two fragments were soluble according to the solubility test, but no result was obtained for Phactr4 because the protein was not expressed sufficiently. The protein purification was optimized to a certain extent, but further optimization is still needed. Some N-terminal fragment protein was obtained with acceptable purity.

The cloned protein fragment can be expressed in suitable bacteria and then purified. The efficiency of the purification of the proteins still needs to be improved further. The purified proteins obtained will be utilized for biochemical binding studies to clarify the molecular mechanism by which Phactr proteins function.

Tämä opinnäytetyö tehtiin Maria Vartiaisen tutkimusryhmälle Biotekniikan Instituuttiin. Työn tavoitteina olivat: 1. Optimoida Phactr4 proteiinin fragmentti Ph4 1-528 kloonaus pET41a vektoriin, 2. Optimoida Phactr4 proteiinin ja sen C- sekä N-terminaalisten fragmenttien tuoton lämpötila, aika sekä suorittaa liukoisuustesti kyseisille proteiineille sekä 3. Optimoida Phactr4 C- ja N-terminaalisten fragmenttien puhdistus.

Kloonauksen eri osia optimoitiin erilaisin tuloksin, mutta kloonaus saatiin suoritettua, kun käytetty vektori vaihdettiin toiseen erään pET41a vektoria. Paras lämpötila ja aika proteiinien tuottamiseen olivat +37oC ja kolme tuntia. Liukoisuustestin tulos kahden fragmenttien osalta oli, että molemmat proteiinit olivat liukoisia. Valitettavasti Phactr4 liukoisuustesti epäonnistui, koska proteiinia ei tuottunut, mutta sen kuitenkin oletetaan olevan myös liukoinen. Proteiinien puhdistuksen optimointi onnistui suhteellisen hyvin ja proteiineja saatiin puhdistettua vaihtelevalla menestyksellä. N-terminaalisen proteiinin tuotto ja puhdistus onnistui toista proteiinia paremmin ja puhdistuksilla saatiin pieni määrä kohtalaisen puhdasta proteiinia.

Kloonattua Phactr4 fragmenttia voidaan kokeilla tuottaa sopivissa bakteereissa sekä yrittää sen puhdistamista. Proteiinien tuotto onnistui hyvin, mutta sitä voidaan halutessa optimoida vielä lisää käyttäen pidempiä tuottoaikoja. Proteiinien puhdistus onnistui melko hyvin, mutta proteiinien puhdistusta on vielä optimoitava runsaasti lisää, jotta saataisiin suurempi määrä vielä puhtaampaa proteiinia talteen. Nyt saatua proteiinia tutkimusryhmä voi käyttää omissa tutkimuksissaan, joilla he pyrkivät selvittämään miten Phactr4 proteiini toimii.