Pesäke-PCR-menetelmän optimointi : Gramnegatiiviset sauvabakteerit

Abstract

Opinnäytetyö tehtiin Helsingin yliopiston mikrobiologian osastolla kokeellisen evoluution tutkimusryhmässä. Opinnäytetyön tarkoituksena oli optimoida menetelmä, jossa PCR suoritetaan bakteeripesäkkeille ilman DNA-eristystä (pesäke-PCR). Optimointi suoritettiin selvittämällä soluliuoksen kolmessa lyysauspuskurissa keittämisen, sentrifugoinnin ja kahden polymeraasientsyymin vaikutus PCR:n tilastollisesti mallinnettuun onnistumistodennäköisyyteen.

Tutkimuksen näytemateriaalina oli kahdeksan bakteerikantaa Helsingin yliopiston HAMBI-kantakokoelmasta. Näytteet valittiin kiinnittämällä huomiota bakteerien kliiniseen merkitykseen. Kaikki tutkimukseen valitut kannat ovat gramnegatiivisia, opportunistisia sauvabakteereja.

Tutkimuksesta kävi ilmi, että PCR-tulokseen vaikutti voimakkaimmin näytteen esikäsittely: Positiivista PCR-tulosta ennusti parhaiten 20 mM NaOH:n käyttäminen lyysauspuskurina. Näytteen sentrifugoinnilla ei ollut tilastollisesti merkitsevää vaikutusta, mutta sentrifugointi johti suurempaan tuotemäärään. PCR-ohjelma, jossa oli käytössä DreamTaq-polymeraasientsyymi, tuotti Phusion-polymeraasientsyymiin verrattuna enemmän positiivisia PCR-tuloksia, mutta tuotti myös enemmän virheitä.

This project was performed at the Experimental Evolution group in the Department of Microbiology, University of Helsinki. The purpose of the study was to optimize a method for PCR amplification from bacterial colonies without DNA extraction (colony PCR). This was achieved by comparing the effect of three lysis buffers, centrifugation of boiled cell suspension and two polymerase enzymes on the statistically modelled probability of a positive PCR outcome.

The study material consisted of eight bacterial strains from the HAMBI culture collection at the University of Helsinki. The strains were chosen based on clinical relevance. All the strains selected for the study are gram-negative, opportunistic rods.

The results of the study showed that sample pre-treatment had the strongest impact on PCR outcome: The best predictor of a positive PCR result was the use of 20 mM NaOH as lysis buffer. Centrifugation did not have a statistically significant effect on PCR success but the use of centrifugation resulted in a higher amount of PCR product. A PCR program using the DreamTaq polymerase enzyme produced a higher number of positive PCR results compared to Phusion, while also producing a higher number of unwanted products.