Ribosomaalisen RNA:n poistomenetelmän kehittäminen suolistomikrobinäytteistä tehtävän cDNA-sekvensointikirjaston valmistusta varten

Abstract

Tämä opinnäytetyö tehtiin Biotekniikan instituutille. Opinnäytetyön tavoitteena oli luoda uusi menetelmä ribosomaalisen RNA:n poistamiseksi RNA-näytteestä suolistomikrobiston aktiivisten geenien tutkimusta varten. Geenien aktiivisuutta voidaan tutkia näytteen lähetti-RNA:ta sekvensoimalla, ja tätä tutkimuksen alaa kutsutaan metatranskriptomiikaksi. Tätä varten tulee näytteistä poistaa tai vähentää ribosomaalista RNA:ta, koska lähetti-RNA:n osuus RNA:sta on vain 1–5 %. Ilman rRNA:n poistoa tehdystä sekvensoinnista saatava data sisältäisi siis yli 90 % tutkimukselle turhaa tietoa.

Eukaryootti mRNA:ssa olevan polyadenosiinihännän vuoksi eukaryoottinen mRNA on mahdollista eristää muusta RNA:sta oligo(dT)-selektiolla. Prokaryoottisolujen kohdalla täytyy turvautua rRNA:n poistamiseen tai vähentämiseen näytteestä, sillä mRNA:ta ei pystytä eristämään muusta RNA:sta.

Menetelmän kehitykseen käytettiin kolmea maitohappobakteerikantaa. Kullekin bakteerikannalle amplifioitiin rRNA:lle komplementaariset biotinyloidut yksijuosteiset PCR-fragmentit, jotka hybridisoitiin RNA-näytteeseen, ja PCR-fragmenteihin hybridisoitu rRNA digestoitiin entsymaattisesti. Tämän jälkeen näytteistä valmistettiin cDNA-kirjastot kaupallisella kitillä ja kirjastot sekvensoitiin.

Näytteiden sekvensseistä 55–76 % mappautui rRNA-operoniin. Sekvenssit, jotka mappautuivat rRNA:han, olivat peräisin PCR-fragmenttien päiden alueilta. Menetelmällä saatiin siis rRNA:ta osin poistettua, mutta sinällään se ei kuitenkaan vielä ole käyttökelpoinen, joten menetelmän kehitystä tulee jatkaa. Kun menetelmä saadaan toimimaan testissä käytetyille testikannoille, menetelmää kokeillaan suolistomikrobinäytteille. Yksittäisestä suolistomikrobinäytteestä valmistetaan biotinyloidut PCR-fragmentit universaaleja alukkeita käyttäen, jolloin saadaan kaikkia näytteessä olevia bakteereja vastaavia PCR-fragmentteja, ja näitä fragmentteja avuksi käyttäen rRNA:n osuutta RNA-näytteessä voidaan vähentää samaa menetelmää hyväksikäyttäen.

This study was done at the Institute of Biotechnology. The aim of the project was to develop a method for decreasing the amount of ribosomal RNA in an RNA sample, which is then used in a cDNA library preparation process. The method will be used for gut microbiota research. Active genes in gut microbiota can be studied using metatranscriptomics where messenger RNA is sequenced. Only 1-5 % of the total RNA is messenger RNA and most of the RNA is ribosomal RNA. This is why sequencing without rRNA depletion generates over 90 % of useless information. This is why rRNA depletion is crucial.

Because of a polyA-tail in eukaryotic mRNA, eukaryotic mRNA can be separated from the rest of the RNA using oligo(dT) selection. Prokaryotic mRNA doesn’t include any specific feature to separate it from the rest of the RNAs, so methods of decreasing the amount of rRNA have been developed.

In this method development project three lactic acid bacteria strains were used as test samples. In this method, biotinylated single-stranded PCR fragments complementary to rRNA were amplified for each bacterium. These fragments were then hybridized to RNA-samples and the RNA, which was hybridized to the fragments, was then enzymatically digested. cDNA libraries were prepared from these samples with a commercial kit and the libraries were sequenced.

55 to 76 % of the sequences were mapped to rRNA operon. Reads that were mapped to the operon were from certain areas from the ends of the used PCR fragments. So, some of the rRNA was successfully depleted by using the method. The method, as it is now, isn’t quite usable but needs further development. When the method works with the test samples, it can be tested with the gut microbe samples. PCR fragments are then amplified using universal primers and one gut microbiota DNA sample. This way it is possible to amplify PCR fragments for all the bacterial species in the gut sample and the amount of rRNA can be decreased, using the same method as developed for the lactic acid bacteria.