DNA-eristysautomaattien käyttöönotto ja eristysmenetelmän validointi viidelle patogeeniselle bakteerille

Abstract

Insinöörityö tehtiin Terveyden ja hyvinvoinnin laitoksen (THL) Terveysturvallisuusosastolla Asiantuntijamikrobiologiayksikössä. Insinöörityön tavoitteena oli ottaa käyttöön kaksi uutta DNA-eristysautomaattia patogeenisten bakteerien DNA-eristystä varten, verrata tuloksia rutiinikäytössä olleeseen manuaalisen kitin avulla tehtyihin eristystuloksiin ja validoida optimaalisin menetelmä kullekin bakteerille. Toiveena oli, että eristysautomaattien avulla saavutettaisiin lyhyemmän aktiivisen työajan lisäksi korkeampia DNA-pitoisuuksia etenkin hankalammin eristettävien grampositiivisten bakteerien kohdalla.

Työn käytännön osuus suoritettiin Terveyden ja hyvinvoinnin laitoksen BSL-2-luokan mikrobiologisessa laboratoriossa. Työhön valittiin viisi eri bakteerilajia ja yhteensä 50 bakteerikantaa. DNA-eristykset tehtiin käyttäen NorDiag Arrow -eristysautomaatilla Viral NA -kittiä ja Analytik Jena InnuPure C16 touch -eristysautomaatilla innuPREP Bacteria DNA -kittiä. Tuloksia verrattiin manuaalisella menetelmällä, Qiagen MagAttrack HMW DNA eristyskitillä, saatuihin tuloksiin. DNA-pitoisuudet mitattiin Invitrogen Qubit -laitteella ja DNA:n puhtaus arvioitiin agaroosigeelielektroforeesilla.

Insinöörityön lopputuloksena saatiin validoitua kullekin patogeeniselle bakteerille optimaalisin eristysmenetelmä perustuen korkeimpaan DNA-pitoisuuteen ja DNA:n riittävään puhtauteen. Eristysautomaatteja verratessa työssä käytetyillä kiteillä Arrow-eristysautomaatti osoittautui jokaisen bakteerin kohdalla paremmaksi vaihtoehdoksi. Agaroosigeelielektroforeesin avulla saatiin arvioitua, että molemmilla eristysautomaateilla saadaan tarpeeksi puhdasta DNA:ta kokogenomisekvensointia varten. Työn tuloksena syntyi myös käyttöohjeet molempien DNA-eristysautomaattien käyttöön.

Työn tulosten perusteella DNA-eristystä voidaan alkaa tehdä Arrow-eristysautomaatin avulla. Protokollaa voi tarvittaessa vielä hioa, sillä tämän työn puitteissa ei ollut tarpeen tehdä esimerkiksi toistomittauksia. Tulosten pohjalta yksikössä on jo aloitettu eristämään Arrow’lla L. monocytogenes -kantojen DNA:ta. InnuPure C16 touch -eristysautomaatilla voisi olla suositeltavaa harkita valmistajan SmartExtraction-menetelmän kokeilemista, sillä DNA-pitoisuudet jäivät osin liian pieniksi kokogenomisekvensointia ajatellen.

This Bachelor’s thesis was carried out in the National Institute for Health and Welfare’s (THL) Health Security Department in Expert Microbiology Unit. The goal of the thesis was to deploy two new automated DNA extraction systems for DNA extraction from pathogenic bacteria, compare the results to manual extraction kit extraction results and validate the most optimal method for each bacteria. The wish was to achieve shorter active working time during DNA extraction process and higher DNA concentrations especially with grampositive bacteria of which DNA is more difficult to extract.

The experimental part of the thesis was performed in THL’s BSL-2 microbiological laboratory. Five different species of bacteria and a total of 50 bacterial strains were chosen for the task. DNA extractions were accomplished with the NorDiag Arrow automated DNA extraction system using the Viral NA extraction kit and the Analytik Jena InnuPure C16 touch automated DNA extraction system using the innuPREP Bacteria DNA extraction kit. The results were compared between the manual MagAttrack HMW DNA extraction kit and automated DNA extraction systems. DNA concentrations were measured with the Invitrogen Qubit device. The purity of the DNA was evaluated with agarose gel electrophoresis.

As the result, the most optimal extraction method was validated for each bacteria considering the highest DNA concentration and sufficient purity of DNA. Between the two automated DNA extraction systems and the kits used with them, Arrow performed better with all particular bacteria. The results of the agarose gel electrophoresis showed that a sufficient purity of DNA can be acquired with both automated DNA extraction systems. As the result of the thesis, instructions for use were also created for both devices.

On the basis of the results, DNA extraction of pathogenic bacteria can be done with the Arrow. Extraction protocols can still be enhanced since there was no need to do repeat measurements in this thesis project. DNA extractions of L. monocytogenes strains have already been done with Arrow in the Expert Microbiology Unit. With the InnuPure C16 touch it could be recommendable to consider testing manufacturer’s SmartExtraction method since DNA concentrations were partly too low for whole genome sequencing.