Saccharomyces cerevisiae -hiivan solunsisäisen pH:n määritys fluoresenssimikroskoopilla
Lähteenmäki, Maija (2010)
Lähteenmäki, Maija
Metropolia Ammattikorkeakoulu
2010
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2010052010033
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2010052010033
Tiivistelmä
Saccharomyces cerevisiae -hiiva on yksi käytetyimmistä malliorganismeista eukarioottisissa solusysteemeissä. Määrittämällä solujen sisäistä pH:a (pHi) reaaliaikaisesti, voitaisiin päästä optimaalisempiin metabolisten yhdisteiden tuotto-olosuhteisiin. Työn tavoitteena oli kehittää ja testata Saccharomyces cerevisiae -hiivan solunsisäisen pH:n mittausmenetelmä fluoresenssimikroskoopilla. Työn suoritus perustui suurelta osin Vallin ym. tekemään tutkimuksen (Intracellular pH distribution in Saccharomyces cerevisiae cell populations, analysed by flow cytometry). Työn kokeellinen osa suoritettiin Valtion teknillisessä tutkimuskeskuksessa.
Solunsisäisen pH:n määrittäminen fluoresenssimikroskoopilla mahdollistaisi nopean ja kohtuullisen halvan analyysin. Määritystä varten solut täytyy leimata fluoresoivalla värillä. Hiivasolujen solunsisäistä pH:ta pyrittiin määrittämään kahdella erilaisella fluoresenssin leimausmenetelmällä. Fluoresoivana leimamolekyylinä toimi joko soluihin siirrostettu mutatoitu E2GFP-proteiini (Green Fluorescent Protein) tai fluoresoiva SNARF-4F-väri, jolla solut värjättiin kasvatuksen jälkeen.
E2GFP-proteiinille on tyypillistä kaksihuippuinen eksitaatio- ja emissiokäyrä. Määrittämällä näytteiden eksitaatiohuippujen intensiteetit voitiin intensiteettien suhteesta määrittää pHi ratiometrisesti, ilman että fluoresoivien proteiinien määrä vaikutti tuloksiin. Fluoresoiva SNARF-4F-väri sisältää esterin, joka hydrolysoituu solun sisällä solunsisäisen esteraasin vaikutuksesta aktiiviseen muotoonsa, protonisensitiiviseksi polyanioniksi, joka on fluoresoiva. SNARF-4F-värillä on kaksihuippuinen emissiospektri, jolloin tuloksista saadaan ratiometrisiä.
Tutkimuksessa ei saatu aikaiseksi fluoresenssimikroskoopilla analysoituna yhtä hyvin sovittuvaa kalibrointikäyrää kuin Vallin ym. tutkimuksessa, kummallakaan fluoresenssin leimausmenetelmällä. SNARF-4F-leimatttujen koesarjojen solut saatiin vastaamaan virtaussytometrillä analysoituna melko hyvin Vallin ym. tutkimuksen tuloksia. E2GFP-leimatut solut saatiin vastaamaan fluoresenssispektroskoopilla analysoituna kohtalaisesti NMR:llä määritettyjen solujen tuloksia.
Yleisesti ottaen fluoresenssimikroskooppi ei todennäköisesti ole riittävän tarkka menetelmä määrittämään hiivasolujen pHi:tä. Fluoresenssimikroskoopilla analysoitujen solujen määrä jää liian pieneksi, ja kuvien analysointi teettää ainakin toistaiseksi liian paljon töitä, jotta reaaliaikainen määritys olisi mahdollista.
Solunsisäisen pH:n määrittäminen fluoresenssimikroskoopilla mahdollistaisi nopean ja kohtuullisen halvan analyysin. Määritystä varten solut täytyy leimata fluoresoivalla värillä. Hiivasolujen solunsisäistä pH:ta pyrittiin määrittämään kahdella erilaisella fluoresenssin leimausmenetelmällä. Fluoresoivana leimamolekyylinä toimi joko soluihin siirrostettu mutatoitu E2GFP-proteiini (Green Fluorescent Protein) tai fluoresoiva SNARF-4F-väri, jolla solut värjättiin kasvatuksen jälkeen.
E2GFP-proteiinille on tyypillistä kaksihuippuinen eksitaatio- ja emissiokäyrä. Määrittämällä näytteiden eksitaatiohuippujen intensiteetit voitiin intensiteettien suhteesta määrittää pHi ratiometrisesti, ilman että fluoresoivien proteiinien määrä vaikutti tuloksiin. Fluoresoiva SNARF-4F-väri sisältää esterin, joka hydrolysoituu solun sisällä solunsisäisen esteraasin vaikutuksesta aktiiviseen muotoonsa, protonisensitiiviseksi polyanioniksi, joka on fluoresoiva. SNARF-4F-värillä on kaksihuippuinen emissiospektri, jolloin tuloksista saadaan ratiometrisiä.
Tutkimuksessa ei saatu aikaiseksi fluoresenssimikroskoopilla analysoituna yhtä hyvin sovittuvaa kalibrointikäyrää kuin Vallin ym. tutkimuksessa, kummallakaan fluoresenssin leimausmenetelmällä. SNARF-4F-leimatttujen koesarjojen solut saatiin vastaamaan virtaussytometrillä analysoituna melko hyvin Vallin ym. tutkimuksen tuloksia. E2GFP-leimatut solut saatiin vastaamaan fluoresenssispektroskoopilla analysoituna kohtalaisesti NMR:llä määritettyjen solujen tuloksia.
Yleisesti ottaen fluoresenssimikroskooppi ei todennäköisesti ole riittävän tarkka menetelmä määrittämään hiivasolujen pHi:tä. Fluoresenssimikroskoopilla analysoitujen solujen määrä jää liian pieneksi, ja kuvien analysointi teettää ainakin toistaiseksi liian paljon töitä, jotta reaaliaikainen määritys olisi mahdollista.