Multiplex qPCR -menetelmän verifiointi hevosen herpesviruksen tyypeille 1 ja 4

Abstract

Tämän opinnäytetyön tarkoituksena ja tavoitteena oli käyttöönottaa perinteistä PCR -menetelmää nopeampi ja tehokkaampi kvantitatiivinen PCR- eli qPCR-menetelmä hevosen herpesvirustyypille 1 ja 4 (Equine Herpesvirus, EHV) Eviran eläinvirologian tutkimusyksikössä. qPCR-menetelmä toteutettiin multiplex-reaktiona eli molemmat virustyypit analysoitiin omien koettimien avulla samanaikaisesti. Materiaalina käytettiin EU-referenssilaboratoriosta (Anses) Ranskasta saatuja EHV-1- ja EHV-4-DNA-näytteitä, Duvaxyn-rokotesuspensiota, joka sisälsi molempia EHV-tyyppejä sekä EHV-1- ja EHV-4-viruskantoja (Kentucky VR700 ja Newmarket), joista tehtiin matriisilaimennossarjat 10-1 ‒ 10-7 hevosen elinsuspensioon, sierainlimaan sekä solujen elatusaineeseen. Menetelmän olosuhteiden optimointi suoritettiin 10-1 - 10-7 rokotesuspensiolaimennossarjalla. Toistettavuuden ja uusittavuuden määrittämiseksi testattiin matriisilaimennossarjat: elinsuspensio- ja elatusainelaimennossarjalla suoritettiin vähintään viisi sekä sierainlimalaimennossarjalla kaksi onnistunutta testauskertaa. Referenssilaboratorion DNA-näytteistä tehtiin laimennossarjat 10-1 - 10-3, joiden avulla määritettiin muun muassa menetelmän tarkkuus.

Tuloksien avulla määritettiin menetelmän objektiivinen tarkkuus, yhdenmukaisuus, spesifisyys, sensitiivisyys, toistettavuus, uusittavuus sekä PCR-tehokkuus. Tarkkuus ja yhdenmukaisuus saatiin referenssinäytteiden EHV-virustyyppikohtaisia tuloksia vertailemalla, sensitiivisyys ja spesifisyys määritettiin vertaamalla referenssinäytteiden tuloksia matriisilaimennossarjojen tuloksiin. Toistettavuus määritettiin yhden tekijän kolmen toiston tulosten variaatiokertoimista, kun taas uusittavuus määritettiin kolmen tekijän toistojen tulosten välisistä variaatiokertoimista. Kaikista muista verifioitavista parametreista, paitsi PCR-tehokkuudesta, saatiin hyvät tulokset. PCR-tehokkuus eri matriiseilla oli viitearvoja suurempi.

Menetelmän verifiointi todettiin onnistuneeksi ja se tullaan liittämään Eviran FINAS-akkreditoituihin qPCR-menetelmiin.

The verification this study concerns was conducted in the Veterinary Virology Research Unit of Finnish Food Safety Authority (Evira) during spring 2018. The goal of the verification was to replace a traditional PCR method for Equine Herpesvirus (EHV) 1 and 4 diagnostics with a more efficient quantitative PCR or qPCR. The qPCR analysis was conducted as a multiplex-reaction, in which both viruses were analyzed at the same time with virus-specific probes.

The study material included EHV-1 and -4 reference DNA-samples from the EU reference laboratory Anses, France, Duvaxyn-vaccine that contained both EHV types, and EHV-1 and -4 virus strains (Kentucky VR700 and Newmarket), from which dilution series to different sample matrices, such as equine organsuspension, cell culture medium and nostril mu-cus, were made. The optimization of qPCR conditions was conducted using a vaccine dilution series from dilution 10-1 to 10-7. After the optimization of the multiplex-reaction, at least five successful tests of 10-1 to 10-7 dilution series from organsuspension and culture medium were done. From nostril mucus, only two dilution series were tested. With matrix dilutions, the repeatability and reproducibility were defined. The dilution series 10-1 to 10-3 of the reference DNA-samples were tested to define the accuracy of the multiplex-reaction.

Using the results, different parameters of the multiplex qPCR method were analysed. The accuracy and conformity were analysed from the results of reference material of both virus types, specificity and sensitivity were analysed by comparing the results of reference material to the results of matrix dilutions. The repeatability was analysed by calculating the coefficient of variation from three repeats performed by the same person and the coefficient of variation for the reproducibility was calculated from the repeats performed by three different persons. Results for the parameters obtained in the verification were as expected. Only the PCR-efficiency calculated from matrix dilutions was greater than generally recommended for optimal qPCR reaction.

All in all, the verification was successful, and the method will be included to the FINAS-accredited qPCR methods of Evira.