Bakteriofagi ϕR1-37:n häntäkarvaproteiinin muokkaus ja ekspressio

Abstract

Tämä opinnäytetyö käsitteli bakteriofagi ϕR1-37:stä peräisin olevan fuusioproteiinin muokkausta. Projektin tarkoituksena oli selvittää bakteriofagin kykyä infektoida eri Yersinia entercolitica -kantoja. Aikaisempien tutkimusten pohjalta tiedettiin, että faagi ϕR1-37 kykenee infektoimaan pintarakenteeltaan täysin erilaisia Yersinia-suvun bakteereja. Tämä oli herättänyt tarpeen selvittää, kuinka faagi infektoi eri isäntäsoluja. Yhtenä vaihtoehtona on, että faagilla on kaksi tai jopa useampia erilaisia häntäkarvaproteiineja. Erilaisten häntäkarvojen avulla se kykenisi tunnistamaan erityyppisiä bakteerien pintarakenteita. Toinen vaihtoehto on, että se kykenee tähän yhden häntäkarvan avulla. Tällöin asia vaatisi lisätutkimuksia infektointimetodin selvittämiseksi.

Projekti toteutettiin käytännössä muokkaamalla fuusioproteiinia, joka sisälsi ϕR1-37-faagin häntäkarvaproteiinin. Aikaisemman tutkimuksen valossa tiedettiin, että proteiinia täytyisi muokata, jotta se saataisiin ilmentymään. Muokkaus päätettiin toteuttaa lisäämällä YadA-varsi häntäkarvageenin ja eGFP:n (vihreä fluoresenssi proteiini) väliin. Tämän toivottiin parantavan proteiinin kolmiulotteista rakennetta ja edesauttavan oikeaa laskostumista. eGFP:n avulla proteiinia vuorovaikutusta bakteerin kanssa voitiin tarkastella fluoresenssia mittaamalla.

Työ toteutettiin muokkaamalla proteiinia koodaavaa geeniä. Valmistettu fuusioproteiinia tuottava plasmidi sekvensoitiin. Sekvenssin perusteella voitiin todeta, että proteiinia koodaava geeni oli saatu muokattua oikeanlaiseksi.

Sitoutumiskokeet tehtiin kasvattamalla eri Yersinia-kantoja ja mittaamalla niistä fluoresenssi mikrotiitterilevynlukijalla sekä tutkimalla niitä fluoresenssimikroskoopilla. Tämän opinnäytetyön puitteissa vain YeO3-R1- sekä YeO3-c-OCR -kantoja ehdittiin tutkimaan. YeO3-R1-kanta toimi positiivisena kontrollina ja negatiivisena kontrollina oli YeO3-c-OCR-kanta. Mikrotiitterilevynlukijalta saadut tulokset olivat epäjohdonmukaisia eikä niiden perusteella voitu päätellä mitään. Fluoresenssimikroskoopilla otetut kuvat olivat puolestaan hyvin havainnollisia. Niiden perusteella voitiin helposti päätellä, että proteiini oli kiinnittynyt YeO3-R1-kantaan mutta ei YeO3-c-OCR-kantaan.

The aim of the project was to modify a fusion protein that originated from bacteriophage ϕRI-37. The purpose was to determine how the phage is able to infect its host cell. From previous studies it is known that the phage is able to infect several different kind of Yersinia strains, even though their surface structures differ greatly from each other. Therefore, further study was required to find out the exact method of infection. One possibility is that the phage has two or several different tail fibers. With these it could recognize and infect different kinds of bacterial surface structures. Another possibility is that it can do this with only one tail fiber. If that were to be the case, further study would be required to solve the infection method.

The project was carried out by modifying a fusion protein that had the tail fiber gene from bacteriophage ϕRI-37. From previous research it was known that the protein as such did not express itself well and needed some modifying. The modifying was done by inserting a YadA stalk between the tail fiber protein and the EGFP (green fluorescent protein). By doing so, the yield and the trimeric structure were hopefully going to be better.

After modification the protein encoding gene was sequenced. The sequence confirmed that the constructed recombinant gene was the correct one.

To check if the protein was able to bind to bacteria, different Yersinia-strains were cultured and incubated with the fusion protein. The fluorescence was measured with a microwell plate reader and the samples were also observed with a fluorescence microscope. Within this project there was only time to examine YeO3-R1- and YeO3-c-OCR –strains. YeO3-R1-strain was the positive control and YeO3-c-OCR the negative control. Results from the first experiment were inconsistent and no conclusion whether the protein was able to bind to bacteria could be made. The pictures taken with the fluorescence microscope, however, were very informative. Based on the pictures it was easy to determine that the protein had bound to YeO3-R1-strain but not to YeO3-c-OCR-strain.