Happamien ja neutraalien lääkeaineiden analyysi PDA- ja CAD-detektorilla varustetulla UPLC-laitteella

Abstract

Tämä opinnäytetyö tehtiin Terveyden ja hyvinvoinnin laitoksen (THL) Oikeustoksikologiayksikön Kytösuontien laboratoriolle. Tavoitteena oli validoida menetelmä happamien ja neutraalien lääkeaineiden määritykseen verinäytteistä UPLC-nestekromatografille, jossa on UV- ja Corona CAD -detektorit.

Happamien ja neutraalien lääkeaineiden analyysi oli Oikeustoksikologiayksikössä aikaisemmin tehty kaasukromatografi-massaspektrometrillä (GC-MS), mutta menetelmässä oli ilmennyt ongelmia yhdisteiden kvantitoinnissa ja uusien lääkeaineiden sopivuudessa kaasukromatografiseen menetelmään. Emäksisten aineiden analyysissä oli jo aiemmin käytetty UPLC-tekniikkaa, ja happamien ja neutraalien aineiden analyysi haluttiin siirtää vastaavalle laitteistolle. Näytteenkäsittelyssä vanhassa menetelmässä käytettiin neste-nesteuuttoa, jossa analyytit uutettiin kokoverinäytteestä orgaaniseen liuottimeen. Myös uuton olosuhteet optimoitiin työn aikana, ja perinteistä neste-nesteuuttoa vertailtiin SLE (Supported Liquid Extraction) -kolonneissa tapahtuvaan uuttoon.

Validoitaviin parametreihin kuuluivat mm. toistettavuus, oikeellisuus, lineaarisuus, määritys- ja toteamisrajat sekä mittausepävarmuus. Validointi tehtiin spiikkaamalla nollaverenä käytettyyn naudanvereen lääkeaineita eri pitoisuuksilla. Lisäksi uutta menetelmää verrattiin vanhalla menetelmällä saatuihin tuloksiin analysoimalla oikeita vainajanäytteitä sekä ulkopuolisen tahon toimittamia laaduntarkkailunäytteitä.

Validointi onnistui hyvin ja täytti menetelmälle asetetut tavoiteparametrit. Tulokset todettiin toistettaviksi ja luotettaviksi, ja uutta menetelmää ja laitetta käytetään jatkossa happamien ja neutraalien lääkeaineiden päivittäisessä seulonnassa. SLE-putket otettiin käyttöön näytteenkäsittelyssä, ja niiden soveltuvuutta pohditaan jatkossa myös muille analyysimenetelmille.

This study was carried out at the National Institute for Health and Welfare Kytösuontie Forensic Toxicology unit in Helsinki. The aim was to develop and validate a method for detecting neutral and acidic pharmaceuticals from blood samples using an Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) system with PDA and CAD detectors.

Neutral and acidic drugs were previously analyzed with Gas Chromatograph –Mass Spectrometer (GC-MS) system, but there had been problems with quantitation of analytes and suitability of some modern pharmaceuticals for a gas chromatographic method. The analysis of basic drugs had already been performed using an UPLC system, and validating neutral and acidic drugs for a similar system would enable them to be used as each other’s replacements in case of a system malfunction.

The sample processing featured a liquid-liquid extraction, in which analytes were extracted from whole blood into organic solvents. Circumstances for extraction were also optimized during validation, and traditional liquid-liquid extraction was compared with Supported Liquid Extraction (SLE).

Parameters to be validated included repeatability, trueness, linearity, limits of detection and quantitation and measurement uncertainty. Validation was performed by adding the analytes to cow blood in different concentrations. Also, real post mortem blood samples and quality control samples were measured and the results were compared with results acquired with other accredited methods.

The validation was successful and met the previously set requirements. The results were repeatable and reliable and the new method was put into service for daily screening of neutral and acidic drug. SLE tubes were brought into use for sample processing, and their suitability for other methods was taken into consideration.