IRMS-menetelmän päivittäminen ja validointi

Abstract

Synteettinen testosteroni on yksi useimmin kilpaurheilussa käytetyistä dopingaineista. Sen käytön havaitseminen on haastavaa, sillä synteettinen ja endogeeninen testosteroni ovat kemiallisesti ja farmakologisesti identtiset. Niiden hiilen isotooppisuhteissa, 12C/13C, on kuitenkin huomattu olevan eroja ja näitä eroja voidaan mitata isotooppisuhdemassaspektrometrisesti (IRMS).

Opinnäytetyö tehtiin Yhtyneet Medix Laboratoriot Oy:n huume-, lääkeaine- ja dopinganalytiikan osastolla, jossa otetaan käyttöön uutta GC-C-IRMS-laitteistoa (kaasukromatografi-poltto-isotooppisuhdemassaspektrometri). Työn tavoitteena oli validoida vanha, osittain käytössä ollut menetelmä, uudelle laitteelle ja tehdä samalla parannuksia menetelmään mahdollisuuksien mukaan, sillä nykyinen menetelmä on hidas ja työläs. Myös Maailman Antidopingtoimisto WADA:n määräysten takia antidopinglaboratoriossa on oltava menetelmä synteettisten endogeenisten steroidien ja niiden metaboliatuotteiden havaitsemiseen. Menetelmä kattaa testosteronin ja sen metaboliitit sekä menetelmäässä käytetyt endogeeniset vertailuyhdisteet.

IRMS-menetelmässä näytteen puhdistukseen käytettäviä LC-fraktiointeja yritettiin lyhentää testaamalla erilaisia LC-metodeja. Validoinnissa määritettiin laitteen lineaarinen mittausalue, menetelmän satunnaisvirhe, systemaattinen virhe, mittausepävarmuus ja tehtiin menetelmävertailua sekä arvioitiin menetelmän toimivuutta ja näytteiden säilyvyyttä.

IRMS-menetelmää ei onnistuttu kehittämään nopeammaksi, mutta pienempiä parannuksia saatiin tehtyä. Validointi on osittain kesken eikä kaikkia suunniteltuja toimenpiteitä menetelmän kehittämiseksi ole vielä kokeiltu. Toistettavuudet ja uusittavuudet ovat hyvät ja tulokset ovat käyttökelpoisia ja niitä hyödynnetään validoinnissa myöhemmin, kun loput validointimittaukset on tehty. Opinnäytetyön ansiosta ollaan lähempänä menetelmän täydellistä validoimista.

Synthetic testosterone is one of the most abundantly used doping agents in sports. Detec-tion of its misuse is a challenge, as the endogenic testosterone is chemically and pharmaco-logically identical to its synthetic analog. However, there are variations in carbon isotopic fractionation between the testosterone from different origins. These isotopic differences can be measured with an isotope ratio mass spectrometer (IRMS).

This bachelor’s thesis study was carried out in United Medix Laboratories Ltd.’s antidoping laboratory where the new GC-C-IRMS System (Gas Chromatography Combustion Isotope Ratio Mass Spectrometer) was being introduced. The target of the work was to improve, if possible, and to validate the previously used method for the new device. A faster method was tried to be developed as it is slow and laborious at present. Due to some regulations of World Anti-Doping Agency WADA, it is also necessary for anti-doping laboratories to have a method for detecting synthetic endogenic steroids and their metabolites. With IRMS method it is possible to detect testosterone, it’s metabolites and the endogenic reference compounds used in the method.

LC-fractionations, that were used to purificate the sample in IRMS method, were tried to be shortened by creating new LC-methods and testing them in practice. Method linearity, preci-sion, bias and measurement uncertainty were defined in validation, and also method com-parison, method fitness for purpose and preservability of the analytes in samples were test-ed.

Minor improvements were made for the IRMS method, but the attempt to shorten LC-fractionations was not successful. Because of numerous delays, the validation work is still going on and there are still some ideas for improving the method that can be tested. The method precision for each compound showed to be adequate. The collected results will be exploited later when the rest of the validation measurements are finished. As a result of this work, achieving the target of completing the method validation is much closer.