MitoXpress Xtra® Oxygen Consumption -kitin toimivuuden testaus Varioskan™ LUX -mikrokuoppalevylukijalla

Abstract

Tässä insinöörityössä selvitettiin Luxcel Biosciences -yrityksen aikaerotteiseen fluorometriaan perustuvan MitoXpress Xtra Oxygen Consumption -analyysikitin toimivuus Thermo Fisher Scientificin Varioskan LUX -mikrokuoppalevylukijalla. Analyysikitillä voidaan mitata solujen ulkopuolisen hapenkulutuksen astetta, joten työhön valittiin kaksi solulinjaa, HELA-S3 ja VAMPIRO-U-2 OS, joita ylläpidettiin ja siirrostettiin mittauksia varten. Työn tavoitteena oli selvittää, voiko analyysikitin fluorokromia, MitoXpress® Xtra -reagenssia, mitata Varioskan LUX -laitteen 334 ± 20 nm:n eksitaatiofiltterillä, kun reagenssin eksitaatiopiikki esiintyy 380 nm:ssä. Mittaukset aloitettiin MitoXpress Xtra -reagenssilla, jossa fluoresenssisignaalia mitattiin 30 µs:n ajan kahdella eri odotusajalla 45 minuutin ajan. Käyttäjä voi asentaa 8 emissiofiltteriä Varioskan LUXiin, joten mittauksessa kokeiltiin 650 ± 12,5 nm:n, 661 ± 10 nm:n ja 665 ± 5 nm:n filttereitä, koska MitoXpress Xtran emissiopiikki esiintyy 650 nm:n aallonpituudessa. Insinöörityön toisessa kokeessa HELA- ja VAMPIRO-soluja mitattiin MitoXpress Xtran ja MitoXpress® Stress Test -kitin reagenssien kanssa samoilla ajoparametreillä kuten edellä. Tällä kertaa testissä oli vain 650 nm:n ja 661 nm:n emissiofiltterit. MitoXpress Xtra Stress -kitti sisältää antimysiini A:ta ja oligomysiiniä, jotka inhiboivat solun hapenkulutusta sekä FCCP:tä ja glukoosioksidaasia, jotka lisäävät sitä. Työn kolmannessa kokeessa molemmista solulinjoista valmistettiin laimennussarja optimaalisen solukonsentraation löytämiseksi MitoXpress Xtralle. Kaikissa kokeissa mikrokuoppalevyn kaivot peitettiin mineraaliöljypisaroilla ylimääräisen hapensaannin estämiseksi. Fluoresenssisignaaleista laskettiin signaalin suhde nollanäytteeseen, signaalin suhde nollanäytteen hajontaan sekä fluoresenssin elinaika. Laskennat osoittivat, ettei Varioskan LUXin erottelukyky riitä detektoimaan MitoXpress Xtra -reagenssia ko. eksitaatiofiltterillä. Signaalitasojen muutos suhteessa aikaan ei myöskään vastannut analyysikitin signaalikäyriä. Eri emissiofilttereillä taikka tietyllä solukonsentraatiollakaan ei ollut vaikutusta tuloksiin. Insinöörityön tavoite saatiin kuitenkin selvitettyä.

In this thesis, the functionality of the time-resolved fluorometry -based MitoXpress Xtra Oxygen Consumption assay of Luxcel Biosciences was examined with the Thermo Fisher Scientific Varioskan LUX multimode micro plate reader. It is possible to measure extracellular oxygen consumption rate with the assay; therefore, two cell lines, HELA-S3 and VAMPIRO-U-2 OS which were maintained and cell cultured, were chosen for the measurements. The aim of the work was to examine if it would be possible to measure the fluorochrome of the assay, MitoXpress® Xtra reagent with a 334 ± 20 nm excitation filter of Varioskan LUX device when the excitation peak of the reagent is shown in 380 nm wavelength. The measurements were started with MitoXpress Xtra reagent where fluorescence signal was measured 30 µs using two different delay times for 45 minutes. It is possible to set 8 emission filters to the Varioskan LUX by the user; therefore, 650 ± 12.5 nm, 661 ± 10 nm and 665 ± 5 nm emission filters were tested in the measurement since the emission peak of the MitoXpress Xtra is shown in 650 nm wavelength. In the second experiment of the thesis, there were HELA and VAMPIRO cells measured with MitoXpress Xtra and reagents of MitoXpress® Stress Test assay using same measurement parameters as mentioned above. This time, only 650 nm and 661 nm emission filters were used in the test. MitoXpress Stress Test assay contains antimycin A and oligomycin, which inhibit the oxygen consumption of the cell. The assay contains also FCCP and glucose oxidase which, in turn, increase the oxygen consumption. In the third experiment, there were dilution series prepared from both cell lines in order to examine the optimal cell concentration for the MitoXpress Xtra. The micro plate wells were covered with mineral oil drops to prevent extra oxygen in all experiments. Signal to blank, signal to noise and lifetime of the fluorescence were calculated from the fluorescence signals. The calculations revealed that the sensitivity of Varioskan LUX was not sufficient to detect MitoXpress Xtra with that particular excitation filter. The change with signal levels according to the time did not match with signal curves of the assay. There was no effect on the results with different emission filters or certain cell concentrations what so ever. However, the aim of the thesis was fulfilled.