Analyzing Chromatin Compaction with FLIM-FRET
Honkanen, Mikko (2019)
2019
All rights reserved. This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2019053013455
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2019053013455
Tiivistelmä
Opinnäytetyön tavoitteena oli toteuttaa vektori, jota voidaan hyödyntää kromatiinin pakkautumisen tutkimisessa. Plasmidi sisältää geenit kahdella eri fluoroforilla, GFP ja mCherry, leimattujen H2B-histonien samanaikaiseen ilmentämiseen elävissä nisäkässoluissa. Käyttäen hyväksi FLIM-FRET–mikroskopiatekniikkaa, kromatiinin pakkautumista voidaan kvantitatiivisesti mitata. Työ suoritettiin Helsingin yliopiston Biotekniikan instituutissa Maria Vartiaisen johtamassa tutkimusryhmässä.
Projekti aloitettiin kloonauksen luonnostelulla. Tarvittavat alukkeet käytettäväksi polymeraasiketjureaktioissa suunniteltiin sisältämään kloonauksessa tarvittavat restriktiokohdat. H2B-insertti monistettiin ennestään löytyneestä konstruktista ja liitettiin IRES-vektoriin, joka mahdollistaa kahden geenin ilmentämisen yhdestä vektorista ja joka ennestään sisälsi GFP-geenin. H2B-mCherry tehtiin liittämällä H2B-insertti mCherry-N3–plasmidiin, josta se kopioituiin PCR:n avulla ja liitettiin IRES-vektoriin. Näin saatiin lopullinen konstrukti H2B-mCherry-pIRES-EGFP-H2B.
Vektorin toimivuuden testaamiseksi suunniteltiin ja toteutettiin pienimuotoinen koe, jossa elävät nisäkässolut transfektoitiin juuri valmistetulla konstruktilla ja sopivilla kontrolleilla. Osa soluista käsiteltiin trikostatiini A–kemikaalilla (TSA), jonka tiedetään aiheuttavan kromatiinin pakkautumisen vähentymistä. FRET-signaalia TSA-käsiteltyjen ja käsittelemättömien solujen välillä verrattiin keskenään.
Vektorin todettiin toimivan jokseenkin odotetusti. Visuaalisesti arvioituna käsiteltyjen ja käsittelemättömien solujen välillä havaittiin selkeä ero, tosin tilastotieteellinen analyysi ei osoittanut merkittävää eroa P-arvolla 0.05. Analysoitujen solujen määrä kokeessa oli vain viisi kutakin olosuhdetta kohden ja luultavasti näytekoon kasvattaminen tulevissa koejärjestelyissä vähentää varianssia ja sitä kautta johtaa parempiin tuloksiin. Yhteenvetona vektori todettiin riittävän toimivaksi, jotta sitä voidaan jatkossa ainakin testata erilaisissa koejärjestelyissä.
Projekti aloitettiin kloonauksen luonnostelulla. Tarvittavat alukkeet käytettäväksi polymeraasiketjureaktioissa suunniteltiin sisältämään kloonauksessa tarvittavat restriktiokohdat. H2B-insertti monistettiin ennestään löytyneestä konstruktista ja liitettiin IRES-vektoriin, joka mahdollistaa kahden geenin ilmentämisen yhdestä vektorista ja joka ennestään sisälsi GFP-geenin. H2B-mCherry tehtiin liittämällä H2B-insertti mCherry-N3–plasmidiin, josta se kopioituiin PCR:n avulla ja liitettiin IRES-vektoriin. Näin saatiin lopullinen konstrukti H2B-mCherry-pIRES-EGFP-H2B.
Vektorin toimivuuden testaamiseksi suunniteltiin ja toteutettiin pienimuotoinen koe, jossa elävät nisäkässolut transfektoitiin juuri valmistetulla konstruktilla ja sopivilla kontrolleilla. Osa soluista käsiteltiin trikostatiini A–kemikaalilla (TSA), jonka tiedetään aiheuttavan kromatiinin pakkautumisen vähentymistä. FRET-signaalia TSA-käsiteltyjen ja käsittelemättömien solujen välillä verrattiin keskenään.
Vektorin todettiin toimivan jokseenkin odotetusti. Visuaalisesti arvioituna käsiteltyjen ja käsittelemättömien solujen välillä havaittiin selkeä ero, tosin tilastotieteellinen analyysi ei osoittanut merkittävää eroa P-arvolla 0.05. Analysoitujen solujen määrä kokeessa oli vain viisi kutakin olosuhdetta kohden ja luultavasti näytekoon kasvattaminen tulevissa koejärjestelyissä vähentää varianssia ja sitä kautta johtaa parempiin tuloksiin. Yhteenvetona vektori todettiin riittävän toimivaksi, jotta sitä voidaan jatkossa ainakin testata erilaisissa koejärjestelyissä.