Keinotekoisten makeutusaineiden määritys ympäristönäytteistä SPE-UPLC-MS/MS-tekniikalla
Mäkelä, Riitta (2010)
Mäkelä, Riitta
Metropolia Ammattikorkeakoulu
2010
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2010112415404
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2010112415404
Tiivistelmä
Keinotekoisten makeutusaineiden käyttö elintarvikkeissa on viime vuosien aikana tullut yhä tavallisemmaksi. Ihmisen elimistö ei juurikaan pysty metaboloimaan näitä synteettisiä molekyylejä, eivätkä ne tutkimusten mukaan pidäty vedenpuhdistusprosessiin vaan suurin osa kulkeutuu puhdistetun jäteveden mukana vesistöihin. Nämä yhdisteet ovat luonteeltaan hyvin stabiileja ja vesiliukoisia – ne säilyvät siten vesistöissä varsin pitkään. Tämä saattaa johtaa makeutusainepitoisuuksiin, joilla voi olla haitallisia vaikutuksia vesiekosysteemissä. Tällä hetkellä ei vielä ole saatavilla riittävästi tutkimustietoa siitä, millaista stressiä eläin- ja kasvikunta kokee normaalia makeammassa ympäristössä.
Opinnäytetyössä kehitettiin Suomen ympäristökeskuksen Tutkimus- ja innovaatiolaboratoriossa analyysimenetelmä, jolla voidaan mitata pinta- ja jätevesimatriisista neljän keinotekoisen makeutusaineen (asesulfaami-K, sakariini, syklamaatti ja sukraloosi) jäämätason pitoisuuksia. Esikäsittelymenetelmäksi valittiin kiinteäfaasiuutto (SPE) käänteisfaasiadsorbentilla. Näytteet tulee suodattaa ennen uuttoa ja pH säätää muurahaishapolla välille 2,4–2,6. Uuttotilavuudeksi optimoitiin 50 ml, eluointitilavuudeksi 6 ml (MeOH) ja uutteen lopputilavuudeksi 0,2 ml (H2O). Näytteen liuotintausta vaihdettiin metanolista veteen sentrifugaalihaihdutuksen avulla.
Menetelmän laitetekniset mittaukset suoritettiin UPLC-MS/MS-yhdistelmätekniikalla. LC-erotuksen ajoliuoksina käytettiin vettä (A) ja metanolia (B), joihin molempiin oli lisätty 2 mM ammoniumasetaattia, joka paransi ionimuotoisten analyyttien retentiota. Gradienttina oli 99,9 % A (2,0 min) → 0,1 % A (0,4 min) → 99,9 % A (0,6 min). LC- ja MS/MS-laitteistojen välinen liitäntä toteutettiin negatiivisella sähkösumutusionisaatiolla (ESI). Detektointimenetelmänä oli Multiple Reaction Monitoring (MRM), jolla kustakin analyytistä seurattiin kahta spesifiä hajoamisreaktiota.
Asesulfaami-K:n, syklamaatin ja sukraloosin osalta saavutettiin saannot, jotka vaihtelivat välillä 75–95 %. Sakariinin kohdalla menetelmän suorituskykyä ei kuitenkaan onnistuttu saamaan yhtä korkealle tasolle: saanto jäi 27 %:iin. Haasteellisin osio saannon kannalta oli SPE-uutto. Sakariinin adsorptiota patruunaan yritettiin parantaa testaamalla muun muassa eri pH-olosuhteita, uuttotilavuuksia ja ionivahvuuksia. Ainoastaan uuttotilavuudella voitiin todeta olevan jonkinlaista vaikutusta sakariinin saantoon.
Kalibrointi osoitettiin riittävän lineaariseksi (R2 0,990–1,000). Mittausalue ylsi tarpeeksi matalalle tasolle ympäristönäytteiden todellisten makeutusainepitoisuuksien kannalta. Määritysrajoiksi (LOQ) arvioitiin asesulfaami-K:lle 1 ng/l, sakariinille 5 ng/l, syklamaatille 2 ng/l ja sukraloosille 7 ng/l. Menetelmään sovellettiin myös isotooppilaimennusmassaspektrometriaa (IDMS), mikä paransi menetelmän luotettavuutta.
Opinnäytetyössä kehitettiin Suomen ympäristökeskuksen Tutkimus- ja innovaatiolaboratoriossa analyysimenetelmä, jolla voidaan mitata pinta- ja jätevesimatriisista neljän keinotekoisen makeutusaineen (asesulfaami-K, sakariini, syklamaatti ja sukraloosi) jäämätason pitoisuuksia. Esikäsittelymenetelmäksi valittiin kiinteäfaasiuutto (SPE) käänteisfaasiadsorbentilla. Näytteet tulee suodattaa ennen uuttoa ja pH säätää muurahaishapolla välille 2,4–2,6. Uuttotilavuudeksi optimoitiin 50 ml, eluointitilavuudeksi 6 ml (MeOH) ja uutteen lopputilavuudeksi 0,2 ml (H2O). Näytteen liuotintausta vaihdettiin metanolista veteen sentrifugaalihaihdutuksen avulla.
Menetelmän laitetekniset mittaukset suoritettiin UPLC-MS/MS-yhdistelmätekniikalla. LC-erotuksen ajoliuoksina käytettiin vettä (A) ja metanolia (B), joihin molempiin oli lisätty 2 mM ammoniumasetaattia, joka paransi ionimuotoisten analyyttien retentiota. Gradienttina oli 99,9 % A (2,0 min) → 0,1 % A (0,4 min) → 99,9 % A (0,6 min). LC- ja MS/MS-laitteistojen välinen liitäntä toteutettiin negatiivisella sähkösumutusionisaatiolla (ESI). Detektointimenetelmänä oli Multiple Reaction Monitoring (MRM), jolla kustakin analyytistä seurattiin kahta spesifiä hajoamisreaktiota.
Asesulfaami-K:n, syklamaatin ja sukraloosin osalta saavutettiin saannot, jotka vaihtelivat välillä 75–95 %. Sakariinin kohdalla menetelmän suorituskykyä ei kuitenkaan onnistuttu saamaan yhtä korkealle tasolle: saanto jäi 27 %:iin. Haasteellisin osio saannon kannalta oli SPE-uutto. Sakariinin adsorptiota patruunaan yritettiin parantaa testaamalla muun muassa eri pH-olosuhteita, uuttotilavuuksia ja ionivahvuuksia. Ainoastaan uuttotilavuudella voitiin todeta olevan jonkinlaista vaikutusta sakariinin saantoon.
Kalibrointi osoitettiin riittävän lineaariseksi (R2 0,990–1,000). Mittausalue ylsi tarpeeksi matalalle tasolle ympäristönäytteiden todellisten makeutusainepitoisuuksien kannalta. Määritysrajoiksi (LOQ) arvioitiin asesulfaami-K:lle 1 ng/l, sakariinille 5 ng/l, syklamaatille 2 ng/l ja sukraloosille 7 ng/l. Menetelmään sovellettiin myös isotooppilaimennusmassaspektrometriaa (IDMS), mikä paransi menetelmän luotettavuutta.