Apoptoosin detektointi diabeettisen hiirimallin munuaisleikkeistä

Abstract

Tämä opinnäytetyö tehtiin Sanna Lehtosen tutkimusryhmässä Helsingin yliopiston Haartman-instituutin patologian osastolla. Tavoitteena oli löytää ja optimoida apoptoosin detektointimenetelmä hiiren munuaisleikkeille.

Munuaisleikkeet olivat peräisin diabeettisesta E1-DN-hiirimallista ja sen verrokkiryhmästä. E1-DN-hiiret sopivat erittäin hyvin hyperglykemian pitkäaikaisvaikutusten, kuten diabeettisen nefropatian, tutkimiseen. Diabeettinen nefropatian ensiasteessa valkuaisia vuotaa virtsaan ja tauti voi lopulta johtaa munuaisten vajaatoimintaan. Komplikaation histopatologiset muutokset, joissa lisääntyneellä apoptoosilla on oma roolinsa, tapahtuvat pääosin munuaiskeräsessä.

Apoptoosin kvantitatiivinen detektointi on erittäin hankalaa prosessin nopeuden takia. Solu käy apoptoosin läpi parissa tunnissa häviten lopulta jälkiä jättämättä. Apoptoosi on geneettisesti ohjelmoitu solukuolema, joka pystytään tunnistamaan sen morfologisista erikoispiirteistä, DNA:n pilkkoutumisesta ja spesifisten apoptoosia säätelevien proteiinien ilmentymisestä. Tässä opinnäytetyössä apoptoottisten solujen detektointiin käytettiin TUNEL-tekniikkaa ja apoptoosiin liittyvän kaspaasi-3-proteiinin immunohistokemiallista värjäystä.

TUNEL-tekniikan validoinnissa käytiin läpi useita menetelmän modifikaatioita huonon signaalin, taustavärjäytymisen ja tulosten vaihtelevuuden takia. Menetelmän optimointi tapahtui pääosin permeabilisoinnissa proteaasi- ja lämpökäsittelyä käyttäen. Muutokset eivät ratkaisseet ongelmia, ja kokeiltavaksi otettiin toinen apoptoosin detektointitapa, kaspaasi-3-proteaasin havainnointi immunohistokemiallisilla menetelmillä. Menetelmässä testattiin immunofluoresenssi ja -peroksidaasileimausta, joista immunoperoksidaasivärjäykset antoivat parhaimmat ja toistettavimmat tulokset. Optimoitua immunoperoksidaasivärjäystä päädyttiin käyttämään diabeettisten hiirien ja niiden verrokkiryhmän apoptoosin analysoinnissa. Tulosten mukaan diabeettisten E1-DN-hiirten glomeruluksissa on keskimäärin enemmän apoptoosia kuin verrokeissa. Tämän tutkimuksen perusteella voidaan todeta, että korkealla verensokerilla on yhteys glomerulussolujen apoptoosin määrän kanssa.

This graduate study was made in Sanna Lehtonen’s research group in the Department of Pathology, Haartman Institute, University of Helsinki. The purpose of the study was to find a way to detect apoptosis from mouse kidney sections.

Kidney samples were taken from a diabetic mouse model E1-DN and a control group. These mice are overtly hyperglycemic but still viable and are therefore an excellent animal model to study longterm consequences of hyperglycemia, such as diabetic nephropathy. Histopathological changes in diabetic nefropathy take place mainly in glomerulus. They can lead to albuminuria and finally can cause end stage renal disease. It is known that the increased rate of apoptosis in glomeruli and tubuli has a role in the development of diabetic nephropathy.

Quantitative detection of apoptosis is difficult because the apoptotic process is extremely rapid. A cell may undergo apoptosis and disappear within 1 or 2 hour. Apoptosis is a gene-driven mode of cell death that can be identified by distinct morphological features, endonuclease initiated DNA degradation and by the involvement of specific apoptosisregulating proteins. In this thesis apoptotic cells were detected using terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL) and immunohistochemistry staining of apoptosis related protease caspase-3 detection.

Several modification and validating steps were made in TUNEL technique because of the weak signal, backround staining and variation between results. The changes in procedure were mainly in permeabilization by using proteinase treatment and heat induced antigen retriewal. Unfortunately these changes did not give the desired results, and therefore another apoptosis detection method, immunohistochemistry staining of caspase-3 protease, was taken in use. These stainings with ABC labeling had good repeatability and quality, and caspase-3 immunohistochemistry stainings were used for the analysis of apoptosis in diabetic and control mice. This study shows that E1-DN homozygous mice have more apoptotic cells in glomeruli than the normal mice. These results indicate that high blood sugar is associated with higher amount of apoptotic cells in glomeruli.