Kvantitatiivisen bioanalyyttisen menetelmän kehitys ja testaus lääketutkimuksessa LC-MS/MS-laitteella

Abstract

Tämä opinnäytetyö tehtiin Orion Pharman bioanalytiikan laboratoriossa Espoossa. Labo-ratorio on osa Orionin tutkimus- ja kehitysosastoa. Laboratoriossa kehitetään jatkuvasti uusia menetelmiä lääkekehityksen alkuvaiheen lääkeainekandidaateille sekä analysoidaan niiden pitoisuuksia erilaisista biologisista matriiseista.

Työn tarkoituksena oli kehittää eräälle lääkekehityksen alkuvaiheen molekyylille tietyt kriteerit täyttävä kvantitatiivinen analyysimenetelmä käyttäen HPLC-MS/MS-laitteistoa. Työssä käytettiin käänteisfaasikolonnia ja kolmoiskvadrupolimassa-analysaattoria. Tutkittavan analyytin kvantitoinnissa käytettiin ulkoisen standardin menetelmää.

Menetelmänkehitys kokonaisuudessaan käsitti näytteenkäsittelytekniikan kehityksen hiiren plasmamatriisille ja nestekromatografin ajo-olosuhteiden sekä massa-analysaattorin asetusten optimoinnin. Menetelmän toimivuutta arvioitiin Orionin sisäisen SOP (Standard Operation Procedure) -toimintaohjeen avulla. Testatut parametrit olivat spesifisyys ja selektiivisyys, kalibrointi, carry over, menetelmän oikeellisuus ja toistettavuus, määritysalaraja ja analyytin säilyvyys. Työssä tutkittiin SOP-toimintaohjeesta poiketen myös saanto ja matriisiefekti.

Menetelmä toimi halutulla tavalla ja täytti kaikki sille asetetut vaatimukset. Analyytin säilyvyystutkimuksissa havaittiin sen säilyvän loppuliuottimessa mutta ei asetonitriiliin valmistetuissa kantaliuoksissa. Analyytin saanto oli noin 90 prosenttia riippumatta sen pitoisuudesta. Matriisiefektiä tutkittaessa havaittiin jonkin hiiren plasmasta peräisin olevan komponentin aiheuttavan matriisiefektiä tutkittavan analyytin retentioajalla, mutta menetelmän toimivuuteen tai toistettavuuteen sen ei havaittu vaikuttavan.

Menetelmä on tällä hetkellä käytössä Orionin bioanalytiikan laboratoriossa. Analyytin säilyvyystutkimuksissa on havaittu, että se hapettuu asetonitriilissä. Menetelmää on tästä syystä edelleen kehitetty siten, että myös analyytin hapettumistuotetta mitataan kalibrointistandardeista, QC-näytteistä sekä tutkimusnäytteistä. Tutkittavan analyytin on havaittu säilyvän metanolissa.

This graduate study was carried out for Orion Pharma’s bioanalytical laboratory at Espoo. The bioanalytical laboratory is a part of the research and development department of Orion Pharma. For drug candidates at discovery phase, new methods are continuously developed and their concentrations are analysed from different biological matrices in the bioanalytical laboratory.

The purpose of this study was to develop quantitative method for one drug candidate in discovery phase that fulfills certain requirements using HPLC-MS/MS-equipment. The study was carried out using reverse phase column and triple quadrupole mass analyser. The quantification was implemented using external calibration.

The study consisted of the development of pre-treatment process for plasma sample and the optimization of run conditions for HPLC and parameters of the mass analyser. The functionality of method was evaluated with Orion’s closed circuit Standard Operation Procedure. The parameters tested were specificity and selectivity, calibration, carry over, the accuracy and the repeatability of the method, the lower limit of quantification and the stability of the analyte. In addition to Standard Operation Procedure, also recovery and matrix effect were tested.

Method worked as expected and filled all the set criteria. The analyte was stable in final solution but not in acetonitrile stock solution. The recovery of the analyte was approximately 90 % regardless of concentration of the analyte. There occurred a matrix effect at the analyte’s retention time, which was probably caused by some component in used plasma. It did not influence the operation or repeatability of the method.

The developed method is in use at the bioanalytical laboratory of Orion. In studies regarding the stability of the analyte it has been noticed that the analyte oxidises in acetonitrile. Therefore, the method has been perfected in a way that the oxidation product of analyte is also detected in calibration standards, QC-samples and research samples. In more exact examinations, it has been discovered that the analyte is stable in methanol.