Fuusioproteiinin kloonaaminen, tuotto ja karakterisointi

Abstract

Geenit ohjaavat kaikkien - niin luontaisten kuin geenitekniikan avulla tuotettujen - proteiinien synteesiä. Nisäkäsgeenien ilmentäminen sellaisenaan bakteereissa on mahdotonta DNA:n proteiinia koodaamattomien intronien takia, joten käänteistranskriptaasien löytäminen viruksista vuonna 1970 oli hyvin merkittävää; ne mahdollistivat geenien eristämisen lähetti-RNA:n kautta.

Tämän opinnäytetyön tavoitteena oli eri fuusioproteiinien kloonaaminen, tuotto E. colissa ja karakterisointi. M-MuLV-käänteistranskriptaasiin liitettiin kuuden histidiinin häntä, His-tag, proteiinin puhdistusta varten ja lisäksi pieni proteiini joko C- tai N-terminaaliseen päähän eri pituisten linkkerien avulla. Tarkoituksena oli löytää sopivin fuusio, jonka myötä RT-entsyymin ominaisuudet, kuten termostabiilisuus, prosessiivisuus ja fideliteetti, paranisivat.

Viiden eri konstruktin kloonaaminen tehtiin perusmolekyybiologisten menetelmien avulla. Puhdistusvaiheessa affiniteettikromatografia yksinään ei riittänyt kontaminoivien endo- ja eksonukleaasien poistamiseen, vaan jouduttiin käyttämään kolmea eri kromatografiapylvästä. His-tag ei muuttanut M-MuLV RT:n ominaisuuksia verrattaessa sitä Finnzymes Oy:n kaupalliseen M-MuLV RT RNase H+:aan. Jos se olisi haitannut entsyymin toimintaa, histidiini-hännällisten fuusioiden tuottamista ei olisi kannattanut jatkaa.

Tuotettaessa fuusioproteiineja niiden liukoisuus osoittautui huonommaksi kuin pelkällä M-MuLV RT:lla. Madaltamalla tuottumislämpötilaa, pidentämällä induktioaikaa sekä suurentamalla kasvatustilavuutta, saatiin isompia solumassoja ja enemmän entsyymiaktiivisuutta. Tähän perustuen entsyymin liukoisuusominaisuudet olivat fuusion myötä muuttuneet.

qRT-PCR:n avulla testattiin puhdistettujen entsyymien kykyä toimia käännettäessä RNA:ta eri pitoisuuksilla cDNA:ksi.

Kaikkia neljää eri fuusiota ei ehditty karakterisoida tämän opinnäytetyön aikana, mutta tutkimuksia jatketaan edelleen. Thermo Fisher Scientificin tuotekehitykseen kuuluvien salassapitosyiden takia muun muassa fuusiopari, linkkerit sekä kloonaamisessa käytettyjen alukkeiden sekvenssit on jätetty kertomatta.

Genes control the synthesis of all proteins, both natural and proteins produced through genetic engineering. Mammalian gene expression as such is impossible in bacteria be-cause of introns which do not encode proteins. For this reason, finding reverse transcrip-tases from viruses was significant because they allowed the isolation of genes via mes-senger RNA.

The target of this graduate study was to clone, express in E. coli and characterize fusion proteins. A 6-histidine tail, His-tag, was attached to the C-terminus of M-MuLV reverse transcriptase to facilitate protein purification. Another protein was fused to either N- or C-terminus of M-MuLV RT with different linkers. The purpose was to find an appropriate fu-sion which will improve the properties of the RT-enzyme such as thermostability, proces-sivity and fidelity.

The cloning of five different constructs succeeded with basic molecular biology methods. It was challenging to remove contaminating endo- and exonucleases in all constructs and, therefore, the proteins were purified using three different chromatography columns. M-MuLV RT with attached His-tag worked in the same way as commercial M-MuLV RT RNase H+ produced by Finnzymes Oy. His-tag did not weaken the properties of the pro-tein. Therefore, it was worthwhile to continue producing fusion proteins with the same af-finity-tag.

When the fusion proteins were produced their solubility was worse than that of M-MuLV RT. Larger cell masses and better enzymatic activities were obtained by decreasing the expression temperature, extending induction time and increasing the growth volume of the bacterial culture. On this basis, it was concluded that the fusion partner had changed the solubility properties of M-MuLV RT.

Purified enzymes were tested by amplifying different amounts of RNA using qRT-PCR.

There was not enough time to characterize all fusions during this graduate study and therefore, the studies will be continued. Thermo Fisher Scientific’s product development includes confidentiality issues, and that is the reason why some things have been left un-disclosed, e.g. the fusion partner, linkers and primer sequences used in cloning.