Endoteliini-1-fuusioproteiinin kloonaaminen ja tuottaminen
Seppänen, Eeva (2010)
Oulun seudun ammattikorkeakoulu
2010
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2010112615742
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2010112615742
Tiivistelmä
Verenpaineen säätelyyn osallistuu useita elimistön tuottamia peptidejä, joista yksi tärkeimpiä on endoteliini-1. Opinnäytetyön tarkoituksena oli tuottaa tioredoksiini-endoteliini-1- (TRX-ET-1) ja glutationi-s-transferaasi-endoteliini-1-fuusioproteiineja (GST-ET-1) Escherichia coli -soluissa. Työ oli osa laajempaa Oulun yliopiston ja VTT:n yhteistyöprojektia, jossa kehitetään molekyylityökaluja ja vasta-aineisiin perustuvaa pikatestiä sydänmarkkereiden määrittämiseksi ihmisnäytteistä.
Työ alkoi endoteliini-1-fuusioplasmidien rakentamisella. Valmiit plasmidikonstruktit transformoitiin XL1-Blue- ja T7express-soluihin kemiallisella transformaatiolla. Transformoiduista soluista seulottiin proteiinintuottoa varten sopivimmat klooniehdokkaat miniprep-eristyksellä ja entsyymikäsittelyllä. Tuotetut proteiinit puhdistettiin lopuksi affiniteettikromatografialla ja puhdistuksen aikana kerätyt näytteet sekä eluoidut proteiinifraktiot analysoitiin SDS-PAGE:lla.
SDS-PAGE-geelien perusteella todettiin, että GST-ET-1-fuusioproteiinin tuotto onnistui ja proteiini saatiin puhdistettua affiniteettikromatografialla. TRX-ET-1-fuusioproteiinin kohdalla tuotto ei kuitenkaan onnistunut. Sekvensoinnissa paljastui, että tuottokloonien sisältämä plasmidi olikin GST-ET-1-fuusioproteiinin tuottoon rakennettua pGEX4T-vaso A -fuusioplasmidia. Jotta rakennettujen fuusioplasmidien proteiinin tuottoa voitaisiin vertailla, tulisi TRX-ET-1-fuusioproteiinia ekspressoiva plasmidikonstrukti valmistaa uusiksi. Jatkossa proteiinin tuottoon paremmin soveltuvammalla fuusioplasmidilla voitaisiin tuottaa endoteliini-1-fuusioproteiinia vasta-aineisiin perustuvia pikatestejä varten.
Työ alkoi endoteliini-1-fuusioplasmidien rakentamisella. Valmiit plasmidikonstruktit transformoitiin XL1-Blue- ja T7express-soluihin kemiallisella transformaatiolla. Transformoiduista soluista seulottiin proteiinintuottoa varten sopivimmat klooniehdokkaat miniprep-eristyksellä ja entsyymikäsittelyllä. Tuotetut proteiinit puhdistettiin lopuksi affiniteettikromatografialla ja puhdistuksen aikana kerätyt näytteet sekä eluoidut proteiinifraktiot analysoitiin SDS-PAGE:lla.
SDS-PAGE-geelien perusteella todettiin, että GST-ET-1-fuusioproteiinin tuotto onnistui ja proteiini saatiin puhdistettua affiniteettikromatografialla. TRX-ET-1-fuusioproteiinin kohdalla tuotto ei kuitenkaan onnistunut. Sekvensoinnissa paljastui, että tuottokloonien sisältämä plasmidi olikin GST-ET-1-fuusioproteiinin tuottoon rakennettua pGEX4T-vaso A -fuusioplasmidia. Jotta rakennettujen fuusioplasmidien proteiinin tuottoa voitaisiin vertailla, tulisi TRX-ET-1-fuusioproteiinia ekspressoiva plasmidikonstrukti valmistaa uusiksi. Jatkossa proteiinin tuottoon paremmin soveltuvammalla fuusioplasmidilla voitaisiin tuottaa endoteliini-1-fuusioproteiinia vasta-aineisiin perustuvia pikatestejä varten.