Ihmisen neutraalin a-mannosidaasin tuottaminen Leishmania tarentolae -alkueläimessä

Abstract

Tässä opinnäytetyössä oli tarkoitus tuottaa glykosidihydrolaaseihin kuuluvaa ihmisen neutraalia α-mannosidaasia (NAM) Leishmania tarentolae -alkueläimessä myöhemmin tehtävää proteiinipuhdistusta, kiteytystä ja edelleen rakennetutkimusta varten.

Työssä käytettiin LEXSY-tuottomenetelmää, joka perustuu rekombinanttiproteiinien tuottoon ihmiselle vaarattomassa alkueläimessä, liskojen parasiitissa, Leishmania tarentolaessa. Leishmania tarentolae -soluissa oli tarkoitus tuottaa sekä erittyvää että solunsisäistä ihmisen NAM:a, jonka kolmiulotteista rakennetta ei vielä tunneta. NAM kuuluu glykosidihydrolaaseihin, joilla on tärkeä merkitys väärin laskostuneiden proteiinien sokeriosien hajottamisessa.

Aikaisemman laboratoriotyön aikana oli kloonattu ihmisen NAM-geeni ekspressiovektoreihin PCR-reaktioilla. Tämä työ alkoi Escherichia coli -transformaatiolla, jossa tuotettiin erittyvää ja solunsisäistä proteiinituottoa varten kloonattuja ekspressiovektoreita sisältävää DNA:ta. Tämän jälkeen DNA:t puhdistettiin ja digestoitiin, jotta E. colissa tuottoon tarvittava osa saatiin poistettua. Digestoidut DNA:t konsentroitiin etanolisaostuksella ennen Leishmania tarentolae -solujen transfektioita, jotka suoritettiin elektroporaatiolla.

Transfektion jälkeen seurattiin erittyvän ja solunsisäisen NAM:n aktiivisuuksia solukasvatuksissa aktiivisuusmittauksilla. Solunsisäinen NAM tuottui aktiivisena mutta erittyvän NAM:in aktiivisuus laski nopeasti eikä sen pidempiaikainen tuotto siis onnistunut. Myöhemmin tehtävää proteiinipuhdistusta varten optimoitiin myös soluhajotusta, jolla solunsisäinen NAM-proteiini saataisiin vapautettua tehokkaasti solujen kasvatusliuokseen.

Tämän työn jälkeen solunsisäistä NAM:ia tuotettiin lisää tilavuudeltaan suuremmissa solukasvatuksissa ja kokeiltiin eri menetelmiä sen puhdistamiseksi.

The aim of this graduate study was to express human neutral α-mannosidase (NAM), which belongs to glycosyl hydrolases, in protozoan Leishmania tarentolae for further protein purification, crystallization and structural research.

In this study, LEXSY-expression system was used. It is based on recombinant protein expression in non-pathogenic, lizard parasite Leishmania tarentolae. The objective was to express both soluble and intracellular human NAM, the 3D-structure of which is not known yet. NAM belongs to glycosyl hydrolases which play important roles in hydrolyzation of glycan structures in misfolded proteins.

During earlier laboratory research, the expression vectors containing the gene encoding human NAM were cloned in PCR-reactions. This research project began with the trans-formation of Escherichia coli where DNAs containing the cloned expression vectors for secretory and intracellular protein expression were produced. After this, DNAs were purified and digested to get rid of E. coli -fragments in expression vectors, which were only for DNA production in E. coli. Digested DNAs were concentrated by ethanol precipitation before Leishmania tarentolae -cells were transfected by electroporation.

The activities of secreted and intracellular NAM in cell cultures were followed by activity assays. The intracellular NAM expressed in an active form but the activity of soluble NAM reduced quickly and thus a longer expression of it did not work. The optimization of cell lysis was also done for protein purification so that the intracellular protein could be released efficiently to the growth medium of cells.

After this study the intracellular NAM was expressed in cell cultures of larger volumes and some methods were also tested in purification of intracellular NAM.