SEMLIKI FOREST -VIRUKSEN NSP3-PROTEIINIMUTANTTIEN KLOONAUS JA TUTKIMINEN

Abstract

Tämä työ tehtiin Helsingin yliopiston Biotekniikan instituutissa Tero Aholan ryhmässä, joka tutkii RNA-virusten replikaatiota ja replikaation inhibitiota. Ryhmän tutkimuskohteena on pääasiassa Semliki Forest -virus, joka on alfavirus. Tässä työssä tutkittiin Semliki Forest -viruksen kolmannen ei-rakenteellisen proteiinin (nsP3) ja amfifysiini II:n kolokalisaatiota sekä sitä, mikä osa nsP3:sta tarvitaan viruksen endosomitargetointiin.

nsP3:ssa on runsaasti proliineja sisältävä alue, jonka on todettu immunosaostuskokeella sitovan amfifysiini II:ta. nsP3:n on havaittu vuorovaikuttavan replikaatiossa tarvittavien isäntäsolun proteiinien kanssa ja osallistuvan replikaatiokompleksin ohjaamiseen solukalvolta endosomiin.

Proliinialueen poistaminen estää sitoutumisen, mutta edelleen amfifysiini II kolokalisoituu osittain virusmutantin replikaatiokompleksin kanssa. Tämän takia tutkittiin, aiheuttaako jokin muu nsP sitoutumisen. Proliinialue poistettiin sekvensseistä P1’2’3, P13 ja nsP3. P1’2’3 ja P13 ovat keinotekoisia rakenteita, eivätkä ne pysty hajoamaan yksittäisiksi nsP:iksi. nsP3:n ja amfifysiini II:n kolokalisaatiota tutkitaan immunofluoresenssimenetelmällä.

Replikaatiokompleksin siirtyminen solukalvolta endosomiin pystytään estämään poista-malla nsP3:sta voimakkaasti fosforoloitunut 50 aminohapon jakso, pistemutaatioilla vaiku-tus ei ole sama. Endosomitargetointi ei siis riipu pelkästään fosforyloinnista. Tämän tutkimiseksi tehtiin viisi nsP3 deleetiorakennetta, joista poistettiin aminohapot: 318 - 368, 359 - 452, 359 - 366, 0 - 318 ja 0 - 368. Deleetiot tehtiin P13- konstruktiin käänteis-polymeraasiketjureaktiolla, jota ekspressoitiin soluissa. Deleetioiden lokalisaatiot tarkasteltiin immunofluoresenssimenetelmällä.

Immunofluoresenssimenetelmällä havaittiin, että nsP3 on vastuussa amfifysiini II:n sitou-tumisesta yksinään. nsP3-deleetioiden perustella näyttäisi siltä, että 318 – 368 jälkeinen alue riittäisi endosomitargetointiin, mutta P13-villityyppi ei ekspressoitunut hyvin, joten tuloksia ei voi pitää luotettavina.

This graduate study was carried out at the Institute of Biotechnology in Tero Ahola’s group that studies RNA virus replication and its inhibition. Semliki Forest virus is an alphavirus and it has four non-structuralproteins (nsPs) like all the alphaviruses. This study concen-trates on nsP3 and contains two parts.

In the first part the colocaliztion of nsP3 and withn amphiphysin II was studied. nsP 3 has a region which contains several prolines. In immune precipitation experiment it turned out that the proline region binds amphiphysin II. If the proline region is removed from the pro-tein, the interaction between nsP3 and amphiphysin II is lost. However, amphiphysin II colocalizates weakly also with replication complexes of mutant virus with deleted proline region. One goal of this study was to find out if nsP1 or nsP2 cause this partial colocaliza-tion. To study this question, the proline region was removed from P1’2’3, P13 and nsP3. P1’2’3 and P13 are artificial constructs, which can not be cleaved to nsP 1-3. The proteins were expressed in cell culture and visualized with immunofluorescence method.

The Second part of this study deals with endosome targeting of the Semliki Forest virus replication complex. Normally replication complex of Semliki Forest virus moves from plasmamembrane to endosomes but if a sequence of 50 highly phosphorylated amino acids from C-terminus of nsP3 is removed, the replication complex stays on plasma membrane. However, the effect is not the same with point mutations that abolish the phosphorylation, so it seems that the endosome targeting does not completely depend on phosphorylation. To investigate this phenomenon, five different deletion constructions were made. The following amino acids were removed from the C-terminus of nsP3: 318 - 368, 359 - 452, 359 - 366, 0 - 318 and 0 - 368. The deletions were made with an inverse polymerase chain reaction to P13 (nsP1 + nsP3) plasmid. P13 plasmid without mutations should move from plasma membrane to endosomes. nsP 1 is responsible for the mem-brane binding of the replication complex. These deletion constructs were expressed in cell culture and visualized with immunofluorescence method.

In this graduate study it was observed with immunofluorescence that nsP3 is the only nsP which binds amphiphysin II. With the deletion constructions it seemed that the region after 318 – 368 would be sufficient for endosome targeting, but the localization of wild type P13 did not follow the expected pattern. Therefore, the results can be considered unreliable.