Rotaviruksen VP6-antigeenin puhdistusmenetelmän kehitys
Mikkonen, Elisa (2019)
Mikkonen, Elisa
2019
All rights reserved. This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2019091018363
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2019091018363
Tiivistelmä
Useiden tärkeiden in vitro -diagnostisten testien toimintaperiaate perustuu vasta-aineiden kykyyn tunnistaa kohdeantigeeni ja sitoutua siihen spesifisesti. Antigeenejä on mahdollista tuottaa korkealaatuisina rekombinanttiproteiineina, joita voidaan käyttää testi- ja kontrolliantigeeneinä lääketieteellisissä tutkimuksissa, diagnostiikassa ja diagnostisten testien laadunvalvonnassa.
Rotavirus A on yleisin vauvojen ja pienten lasten vakavien ripulitautien aiheuttaja. Rotavirusinfektion rutiinidiagnostiikka perustuu rotavirusantigeenin havaitsemiseen potilasnäytteissä. Rotaviruksen kapsidin immunogeeninen rakenneproteiini, virusproteiini 6 (VP6), on hyvin konservoitunut eri rotavirus A -kantojen välillä, joten se sopii hyvin diagnostiseksi antigeeniksi.
Työn tavoitteena oli kehittää rekombinanttisen VP6-antigeenin puhdistusmenetelmää. VP6-antigeeni tuotettiin Escherichia colissa (E. coli) fuusioproteiinina, jossa pieni ubikitiinin tyyppinen modifikaattori (Small Ubiquitin-Like Modifier, SUMO) oli liitetty VP6-proteiiniin. Tuotettu SUMO-VP6-fuusioproteiini puhdistettiin nikkeli(Ni)-affiniteettikromatografialla kahdessa eri vaiheessa. Ensimmäisessä vaiheessa SUMO-VP6-proteiini puhdistettiin lysaatista. Toisessa vaiheessa fuusioproteiinin SUMO-osa pilkottiin fuusioproteiinista entsymaattisesti, minkä jälkeen VP6-proteiini erotettiin irronneesta SUMO-osasta. Lopputuotteen immunoreaktiivisuus määritettiin fluoroimmunoanalyysillä (FIA) ja puhtaus natriumdodekyylisulfaattipolyakryyliamidigeelielektroforeesilla (SDS-PAGE).
Tulosten perusteella VP6-antigeenin tuottaminen SUMO-VP6-fuusioproteiinina toimi hyvin, mutta VP6-antigeenin puhdistaminen ei ollut täysin suoraviivaista. VP6-antigeenin luontainen taipumus muodostaa trimeerejä sekä suurempia proteiininkomplekseja hankaloitti puhdistusmenetelmän optimointia. SUMO-VP6-fuusioproteiinin havaittiin eluoituvan gradientin eri vaiheissa, mikä todennäköisesti aiheutui muodostuneiden SUMO-VP6-proteiinikompleksien sisältämien polyhistidiinihäntien erilaisista vuorovaikutuksista Ni-affiniteettipylvään kanssa. Epälineaarisen eluoitumisen vuoksi lopputuotteen saannon maksimoiminen puhtautta heikentämättä oli haastavaa: lopputuotteessa havaittiin epäpuhtauksia ja lopputuotteen immunoreaktiivisuus oli kontrolliin verrattuna selvästi heikompi.
Rotavirus A on yleisin vauvojen ja pienten lasten vakavien ripulitautien aiheuttaja. Rotavirusinfektion rutiinidiagnostiikka perustuu rotavirusantigeenin havaitsemiseen potilasnäytteissä. Rotaviruksen kapsidin immunogeeninen rakenneproteiini, virusproteiini 6 (VP6), on hyvin konservoitunut eri rotavirus A -kantojen välillä, joten se sopii hyvin diagnostiseksi antigeeniksi.
Työn tavoitteena oli kehittää rekombinanttisen VP6-antigeenin puhdistusmenetelmää. VP6-antigeeni tuotettiin Escherichia colissa (E. coli) fuusioproteiinina, jossa pieni ubikitiinin tyyppinen modifikaattori (Small Ubiquitin-Like Modifier, SUMO) oli liitetty VP6-proteiiniin. Tuotettu SUMO-VP6-fuusioproteiini puhdistettiin nikkeli(Ni)-affiniteettikromatografialla kahdessa eri vaiheessa. Ensimmäisessä vaiheessa SUMO-VP6-proteiini puhdistettiin lysaatista. Toisessa vaiheessa fuusioproteiinin SUMO-osa pilkottiin fuusioproteiinista entsymaattisesti, minkä jälkeen VP6-proteiini erotettiin irronneesta SUMO-osasta. Lopputuotteen immunoreaktiivisuus määritettiin fluoroimmunoanalyysillä (FIA) ja puhtaus natriumdodekyylisulfaattipolyakryyliamidigeelielektroforeesilla (SDS-PAGE).
Tulosten perusteella VP6-antigeenin tuottaminen SUMO-VP6-fuusioproteiinina toimi hyvin, mutta VP6-antigeenin puhdistaminen ei ollut täysin suoraviivaista. VP6-antigeenin luontainen taipumus muodostaa trimeerejä sekä suurempia proteiininkomplekseja hankaloitti puhdistusmenetelmän optimointia. SUMO-VP6-fuusioproteiinin havaittiin eluoituvan gradientin eri vaiheissa, mikä todennäköisesti aiheutui muodostuneiden SUMO-VP6-proteiinikompleksien sisältämien polyhistidiinihäntien erilaisista vuorovaikutuksista Ni-affiniteettipylvään kanssa. Epälineaarisen eluoitumisen vuoksi lopputuotteen saannon maksimoiminen puhtautta heikentämättä oli haastavaa: lopputuotteessa havaittiin epäpuhtauksia ja lopputuotteen immunoreaktiivisuus oli kontrolliin verrattuna selvästi heikompi.