DNA-polymeraasin karakterisointi, tuotantoprosessin tutkiminen ja LC-MS-menetelmän kehitys

Abstract

Opinnäytetyö toteutettiin Thermo Fisher Scientific Oy:n Vantaan toimipisteessä, Mikrobiologian divisioonan Food Safety Protection R&D osastossa. Osaston tehtäviin kuuluu mm. kehittää PCR-tuotteita tunnistamaan patogeenisiä mikro-organismeja ruokanäytteistä.

Työn tavoitteena oli tutkia DNA-polymeraasientsyymin ominaisuuksia ja tuotantoeräkohtaisia eroja. DNA-polymeraasientsyymi tuotteesta halutiin kehittää LC-MS-karakterisointimenetelmiä erojen tunnistamiseksi. DNA-polymeraasin ominaisuuksista tarkastellaan konsentraatio, puhtaus ja rakenne. Proteiininkonsentraatio ja puhtaus määritettiin Bradford- ja SDS-PAGE -analyyseillä.

DNA-polymeraasin rakenteen tutkimista varten kehitettiin LC-MS-menetelmä, jossa pystyttiin tutkimaan entsymaattisesti pilkottuja peptidejä. Työssä osallistuttiin uusimman erän tuotannossa, jossa tavoitteena on tutkia ja mahdollisesti optimoida tuotantoprosessia.

Työssä saatiin hyödyllistä tietoa DNA-polymeraasin rakenteesta ja vaihtelusta. Vaikka tämän työn tulosten perusteella ei todettu vaihtelun olevan merkitsevä DNA-polymeraasin toimintaan, sitä tullaan tutkimaan lisää.

LC-MS-menetelmä ei onnistunut täysin aikarajoituksien vuoksi, ja vaatii menetelmän optimointia. LC-MS-menetelmän osittaisen epäonnistumisen syy on tutkittu, ja se on todettu johtuvan osittain ionisaation stabiilisuudesta. Tässä työssä kehitettyä menetelmää tullaan käyttämään pohjana tulevissa jatkotutkimuksissa.

Opinnäytetyöstä on saatu hyödyllistä tietoa DNA-polymeraasientsyymistä ja pystytään suunnittelemaan jatkotutkimuksia tämän työn tulosten perusteella. On myös alustavasti kehitetty LC-MS-menetelmä, josta voi jatkaa optimointia

This study was conducted at Thermo Fisher Scientific Oy Vantaa site, in microbiology division’s Food Safety R&D department. One of this department’s responsibilities include developing PCR products to identify food pathogens.

The purpose of this study was to examine the properties of DNA polymerase enzyme and its variations between different production lots. The aim was to develop an LC-MS method to identify DNA polymerase’s composition. Properties of DNA polymerase that were tested include concentration, purity and composition. This protein’s concentration and purity were tested with Bradford and SDS-PAGE analysis methods.

An LC-MS method was developed to analyze the composition of digested DNA polymerase peptides. The production of the newest lot was participated in, where the aim was to analyze and optimize the production process.

The LC-MS method didn’t fully work and requires further optimization. Reason for LC-MS method’s failure was analyzed and determined to be partially due to stability issues in ionization. The developed method in this study will be used as a template for future studies.

In this study Important information was obtained about DNA polymerase’s composition and variations. Despite this study’s results, the differences were determined to be not significant to the performance of DNA polymerase. Further studies will be conducted to test the significance of the variation. An LC-MS method was tentatively developed and only requires further optimization.