Establishing a Nucleic Acid-based Assay to Detect Signatures of Proteostatic Stress
Salomaa, Jesse (2019)
2019
All rights reserved. This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2019120625219
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2019120625219
Tiivistelmä
Tämä projekti toteutettiin Biomedicum Helsingissä Thomas G. McWilliamsin laboratoriossa. Projektin tavoitteena oli tuottaa menetelmä endoplasmakalvoston (ER) stressin havaitsemiseen sekä tutkia, aiheuttaako yhdiste FI0612 sitä IRE1-proteiinin säätelemällä reaktioreitillä. Havaitseminen perustui ER-stressin aiheuttamaan XBP1-mRNA:n silmukointiin. Pohjana projektissa käytettiin toisen laboratorion käytössä ollutta protokollaa.
Kahta eri viljeltyä ihmissolulinjaa käsiteltiin FI0612:lla sekä kontrolliyhdisteillä. Tietyn ajan kuluttua RNA eristettiin soluista. RNA:sta syntetisoitiin cDNA:ta käänteistranskriptiolla. XBP1-geeni amplifioitiin polymeraasiketjureaktiolla (PCR). PCR-tuotteet analysoitiin agaroosigeelielektroforeesilla (AGE).
Kontrolliyhdisteet toimivat odotetusti ja menetelmä todettiin toimivaksi. FI0612 ei aiheuttanut ER-stressiä missään projektissa käytetyissä olosuhteissa. Menetelmästä kirjoitettiin protokolla laboratoriolle myöhempää käyttöä varten.
Menetelmä toteutettiin kokonaisuudessaan useita kertoja ja todettiin luotettavaksi. Menetelmää optimoitiin projektin aikana, erityisesti AGE:n osalta.
Kahta eri viljeltyä ihmissolulinjaa käsiteltiin FI0612:lla sekä kontrolliyhdisteillä. Tietyn ajan kuluttua RNA eristettiin soluista. RNA:sta syntetisoitiin cDNA:ta käänteistranskriptiolla. XBP1-geeni amplifioitiin polymeraasiketjureaktiolla (PCR). PCR-tuotteet analysoitiin agaroosigeelielektroforeesilla (AGE).
Kontrolliyhdisteet toimivat odotetusti ja menetelmä todettiin toimivaksi. FI0612 ei aiheuttanut ER-stressiä missään projektissa käytetyissä olosuhteissa. Menetelmästä kirjoitettiin protokolla laboratoriolle myöhempää käyttöä varten.
Menetelmä toteutettiin kokonaisuudessaan useita kertoja ja todettiin luotettavaksi. Menetelmää optimoitiin projektin aikana, erityisesti AGE:n osalta.