Kvantitatiivisten reaaliaikaisten EBV- ja BKV-PCR-menetelmien verifiointi Stratagene Mx3005P-laitteelle

Abstract

Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR on nopea ja herkkä menetelmä nykypäivän virusdiagnostiikassa. Menetelmällä voidaan osoittaa näytteestä hyvinkin pieniä virusmääriä. Epstein-Barrin virus (EBV) ja BK-virus (BKV) ovat kaksisäikeisen DNA:n omaavia yleisiä taudinaiheuttajia. Näiden virusten määri-tys on tärkeää etenkin elinsiirto- ja syöpäpotilaiden tautidiagnostiikassa.

Teimme opinnäytetyömme HUSLABin virologian osastolle. Työmme tarkoituksena oli selvittää kvanti-tatiivisten reaaliaikaisten EBV- ja BKV-PCR-menetelmien soveltuvuus määritettäväksi Stratagene Mx3005P-laitteella. Määritimme 210 EBV-plasmanäytettä, joista 128 oli positiivisia ja 82 negatiivisia sekä 106 BKV-plasmanäytettä, joista 40 oli positiivisia ja 66 negatiivisia. Toistettavuuden selvittämistä varten valitsimme kaksi eritasoista EBV-näytettä ja kolme eritasoista BKV-näytettä. Työssä tutkitut näytteet olivat pakastettuja potilas- ja laadunvalvontanäytteitä, joiden viruspitoisuudet oli aiemmin määritetty ABI Prism 7900-laitteella. Virusten DNA:n eristämiseen näytteistä käytettiin automaattista nukleiinihappoeristyslaitetta, MagNA Pure LC ja määrityksiin reaaliaikaista PCR-laitetta, Stratagene Mx3005P. Molempien tutkittavien menetelmien toiminta perustui ns. TaqMan®-menetelmään.

Työssä vertailimme saatuja tuloksia ja niiden yhdenmukaisuutta keskenään. Tutkimme menetelmällä saatujen tulosten toistettavuutta, korrelaatiota, herkkyyttä sekä tarkkuutta. Tulokset analysoimme kol-mella eri algoritmilla: adaptiivinen normalisoitu (EBV, BKV), non-adaptiivinen normalisoitu (EBV, BKV), non-adaptiivinen ei-normalisoitu (EBV) ja adaptiivinen ei-normalisoitu (BKV).

Saamiemme tulosten korrelaatiot olivat erittäin vahvoja (p=0,000 EBV ja p=0,000 BKV) ja tulokset korreloivat keskenään erittäin voimakkaasti. Sen sijaan toistettavuus ei ollut aivan toivomallamme ta-solla, mutta herkkyys ja tarkkuus olivat hyviä. Saadut tulokset tukivat aiempaa olettamusta. Tästä joh-tuen Stratagene Mx3005P soveltuu mielestämme varalaitteeksi EBV- ja BKV-määrityksiin.

Quantitative real-time PCR (qPCR) can provide a fast and sensitive method in today's viral diagnostics. With this technique one is able to detect specific DNA from even low numbers of viruses in plasma. Epstein-Barr virus (EBV) and BK-virus (BKV) are common pathogens with double-stranded DNA. Detection of these viruses is important in diagnoses of transplant recipients and cancer patients.

We made our final project for the HUSLAB Department of Virology. The objective of this study was to determine the suitability of a Stratagene Mx3005P analyzer for EBV and BKV quantitation. We ana-lyzed 210 EBV plasma samples. From the samples 128 were EBV-positive and 82 samples were nega-tive. We also analyzed 106 BKV samples. From these samples 40 were BKV-positive and 66 were negative. To evaluate repeatability, we chose two EBV and three BKV samples of a different level. In this study samples were frozen patient and quality control samples and they were analyzed earlier using an ABI Prism 7900 analyzer. In both assays we used an automated sample preparation system, MagNA Pure LC and real time PCR Stratagene Mx3005P analyzer. The quantification assay was based on TaqMan®-detection.

We tested the specificity, sensitivity and repeatability. We also compared the results and their correla-tion. We analyzed the results with three different algorithms: adaptive normalized (EBV, BKV), non-adaptive normalized (EBV, BKV), non-adaptive non-normalized (EBV) and adaptive non-normalized (BKV).

Results showed that the correlation between ABI Prism 7900 and Stratagene Mx3005P was statistically significant with both viruses (p=0,000 EBV ja p=0,000 BKV) Repeatability was instead not as good as we expected. Our conclusions supported previous hypotheses and therefore we consider that the Strata-gene Mx3005P analyzer is suitable for the quantitative detection of EBV and BKV.