Assessment of sigK Deletion on Clostridium botulinum Group II Type E Sporulation and Toxin Production
Laurila, Krista (2020)
Laurila, Krista
2020
All rights reserved. This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-202003143429
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-202003143429
Tiivistelmä
Opinnäytetyön tavoitteena oli tutkia sigmatekijä K:n poiston vaikutuksia Belugan, Clostridium botulinum ryhmä II tyyppi E -kannan itiönmuodostukseen sekä toksiinin tuottoon. C. botulinum -bakteerin useat kannat eroavat toisistaan, eikä eri kantojen geneettisiä toimintatapoja tunneta vielä kovin tarkasti. Tämän anaerobisen bakteerin erittämä hermomyrkky botuliini on myrkyllisin tunnettu toksiini, ja sen tuottamat itiöt voivat selviytyä ja kasvaa ruuassa jopa kuumennuksen jälkeen. Hermomyrkyn aiheuttama botulismi on hengenvaarallinen ja parantumaton tauti, joten lajin tuntemus on tärkeää sairastapausten ehkäisemiseksi. Projekti suoritettiin Helsingin yliopiston Eläinlääketieteellisen tiedekunnan Elintarvikehygienian ja ympäristöterveyden osastolle, C. botulinum -laboratorion tiloissa.
Projektissa tutkittiin laboratoriossa eri menetelmillä kolmen kymmenen päivän jakson aikana C. botulinum ryhmä II tyyppi E Beluga -kantaa, josta oli poistettu sigK-geeni. Kantaa verrattiin villityyppiin sekä kantaan, josta sigK oli poistettu kromosomista ja lisätty bakteeriin plasmidissa. Mittauksia tehtiin 24 tunnin välein 120 tuntiin asti ja viimeiset mittaukset tehtiin, kun viljelystä oli kulunut 240 tuntia. Työskentely suoritettiin suurelta osin 30 °C:ssa anaerobikaapissa.
Ensimmäisten viikkojen aikana laboratoriotutkimus toteutettiin kolmella eri menetelmällä. Näytteitä kuvattiin fluoresenssimikroskoopilla, OD-mittauksilla arvioitiin niiden optista tiheyttä ja MPN-menetelmällä selvitettiin elinkelpoisten solujen sekä kuumennuskäsittelyä sietävien itiöiden määrää. Sen jälkeen ELISA-testeillä määritettiin näytteiden toksiinikonsentraatioita ja mikroskoopilla otettuja kuvia tulkitsemalla laskettiin itiönmuodostuksen eri vaiheissa olevien bakteerien määriä.
Tulosten perusteella näyttäisi siltä, että sigK:n puutos Beluga-kannassa vaikuttaa negatiivisesti itiönmuodostuksen viimeisiin vaiheisiin. Bakteerit eivät vapauttaneet suurinta osaa itiöitä, vaan ne jäivät niiden sisään. Itiöiden kypsymisvaiheen kehitys vaikutti myös jääneen kesken. Bakteeripopulaatio pieneni ajan myötä huomattavasti, todennäköisesti elinkelpoisten itiöiden puutteen vuoksi. Toksiinia havaittiin villityyppiin verraten enemmän eri aikoina, mutta suurinta osaa siitä ei eritetty bakteerin ulkopuolelle. Kanta, johon sigK oli lisätty plasmidissa, reagoi samankaltaisesti, mutta vaikutukset eivät olleet yhtä voimakkaita. Tämä tarkoittaa, ettei geenin komplementaatio onnistunut täydellisesti. Saatuja tuloksia voidaan hyödyntää tulevissa tutkimuksissa C. botulinum -bakteeriin liittyen.
Projektissa tutkittiin laboratoriossa eri menetelmillä kolmen kymmenen päivän jakson aikana C. botulinum ryhmä II tyyppi E Beluga -kantaa, josta oli poistettu sigK-geeni. Kantaa verrattiin villityyppiin sekä kantaan, josta sigK oli poistettu kromosomista ja lisätty bakteeriin plasmidissa. Mittauksia tehtiin 24 tunnin välein 120 tuntiin asti ja viimeiset mittaukset tehtiin, kun viljelystä oli kulunut 240 tuntia. Työskentely suoritettiin suurelta osin 30 °C:ssa anaerobikaapissa.
Ensimmäisten viikkojen aikana laboratoriotutkimus toteutettiin kolmella eri menetelmällä. Näytteitä kuvattiin fluoresenssimikroskoopilla, OD-mittauksilla arvioitiin niiden optista tiheyttä ja MPN-menetelmällä selvitettiin elinkelpoisten solujen sekä kuumennuskäsittelyä sietävien itiöiden määrää. Sen jälkeen ELISA-testeillä määritettiin näytteiden toksiinikonsentraatioita ja mikroskoopilla otettuja kuvia tulkitsemalla laskettiin itiönmuodostuksen eri vaiheissa olevien bakteerien määriä.
Tulosten perusteella näyttäisi siltä, että sigK:n puutos Beluga-kannassa vaikuttaa negatiivisesti itiönmuodostuksen viimeisiin vaiheisiin. Bakteerit eivät vapauttaneet suurinta osaa itiöitä, vaan ne jäivät niiden sisään. Itiöiden kypsymisvaiheen kehitys vaikutti myös jääneen kesken. Bakteeripopulaatio pieneni ajan myötä huomattavasti, todennäköisesti elinkelpoisten itiöiden puutteen vuoksi. Toksiinia havaittiin villityyppiin verraten enemmän eri aikoina, mutta suurinta osaa siitä ei eritetty bakteerin ulkopuolelle. Kanta, johon sigK oli lisätty plasmidissa, reagoi samankaltaisesti, mutta vaikutukset eivät olleet yhtä voimakkaita. Tämä tarkoittaa, ettei geenin komplementaatio onnistunut täydellisesti. Saatuja tuloksia voidaan hyödyntää tulevissa tutkimuksissa C. botulinum -bakteeriin liittyen.