Suhteellisen telomeeripituuden määrittäminen qPCR-tekniikalla

Abstract

Tämän työn tavoitteena oli määrittää DILGOM-aineistosta näytteiden suhteellinen telomeeripituus qPCR:n (kvantitatiivinen polymeraasiketjureaktion) avulla. Työssä käytetty DILGOM-aineisto (N = 4 300) on osa Terveyden ja hyvinvoinnin laitoksen (THL) FINRISKI-tutkimusta. Telomeerit ovat kromosomien päässä olevia DNA-pätkiä, jotka koostuvat toistuvista DNA-jaksoista (5´-(TTAGGG)n-3´) ja proteiineista. Telomeerit ovat elintärkeitä solun normaalille toiminnalle, ne esimerkiksi estävät kromosomien fuusioitumisen toisiinsa ja suojaavat toiminnallista DNA:ta. Joka kerta solun jakautuessa telomeeri kuluu hieman. Tämän ilmiön on ajateltu olevan tärkeä tekijä vanhenemisessa. Tässä työssä suhteellinen telomeeripituus määritetään verestä eristetystä genomisesta DNA:sta. Telomeeripituus saadaan määritettyä qPCR-pohjaisella menetelmällä laskemalla T/S-suhde määritettyjen telomeeri- ja yhden kopion geenin (hemoglobiinin beta-proteiinia koodaava geeni, HBB) arvoista. Kaikki qPCR-reagenssit testattiin ennen näyteajojen aloittamista. Näytteet kuivattiin optisille 384-qPCR-levyille, samaten kuin standardit ja kontrollit. Näytteet ajettiin qPCR:llä ja tulokset analysoitiin CFX Manager 2.0- ja PASW Statistics 18 -ohjelmilla. Analysoinnissa katsottiin muun muassa iän, sukupuolen ja DNA:n eristysmenetelmän vaikutusta ja merkitsevyyttä suhteelliseen telomeeripituuteen. Iällä todettiin olevan merkitsevä vaikutus telomeeripituuteen (p = 8,22 * 10-33). Sukupuoli oli myös merkitsevä tekijä (p = 0,045), vaikka merkitsevyys ei ollut yhtä voimakas kuin iän merkittävyys. DNA:n eristysmenetelmän todettiin olevan erittäin merkitsevä (p = 3,16 * 10-81).

The goal of this thesis was to determine relative telomere length from DILGOM-sample using qPCR. DILGOM-sample is part of the national FINRISK study performed by the Finnish National Institute for Health and Welfare. Telomeres are found in the ends of chromosomes and are made of replicated DNA se-quences (5´-(TTAGGG)n-3´) and proteins. Telomeres are vital to cell’s everyday functions for example protecting the functional DNA and preventing the fusion of two chromosomes. Every time a cell divides telomeres get a bit shorter. This phenomenon is probably an important mechanism in ageing. In this thesis relative telomere length was measured from genomic DNA isolated from blood. Telomere length can be measured by qPCR by calculating a T/S ratio from telomere and single copy genes (hemoglobin’s beta-protein coding gene, HBB) signal values. All of the qPCR reagents were tested before the test runs. Samples, standards and con-trols were dried onto optical 384-well qPCR-plates. qPCR reactions were run and results were analysed with CFX Manager 2.0 and PASW Statistics sofware. In the analysis, relative telomere length was compared to the age, sex and DNA extraction method. Age has a strong effect on telomere length (p = 8,22*10-33). Sex shows also some evidence for affecting telomere length (p = 0,045). DNA’s extraction method has a very strong effect on telomere length (p = 3,16*10-81).