Hiiren indusoitujen pluripotenttien kantasolukloonien karakterisointi

Abstract

Tämä opinnäytetyö tuotettiin Terveyden ja hyvinvoinnin laitokselle (THL) tutkimusryhmässä, joka kehittää solu- ja koe-eläinmalleja kansantautien mekanismien tutkimukseen. Ryhmän yhtenä tutkimusvälineenä ovat hiiren indusoidut pluripotentit kantasolut (iPS-solut). Ne ovat somaattisista soluista geenisiirrolla pluripotentiksi eli monikykyiseksi uudelleenohjelmoituja kantasoluja, jotka voivat erilaistua alkion kaikiksi kolmeksi solukerrokseksi. Ryhmä on kehittänyt uuden poistogeenisen hiirimallin NCL-proteiinien vuorovaikutusten tutkimukseen, ja erot mutanttihiirien ja villityypin hiirien välillä tulee pystyä osoittamaan toistettavasti useilla eri iPS-soluklooneilla. Tämän työn puitteissa karakterisoin kaksi villityypin solukloonia ja kolme mutanttikloonia. Työn tarkoituksena oli tutkia, ilmentävätkö kloonit markkereita, jotka osoittavat kloonien olevan sekä kantasoluja että monikykyisiä. Jos kloonit ovat kaikilta tutkittavilta ominaisuuksiltaan monikykyisiä kantasoluja, niitä voidaan käyttää jatkotutkimuksen työvälineinä. Karakterisointityössä kloonien kantasoluominaisuuksia tutkittiin morfologian, pintamarkkereiden ja geenimarkkereiden perusteella. Morfologiaa tutkittiin soluviljelmiä mikroskopoimalla. Tutkitut kantasoluspesifiset pintamarkkerit olivat alkalisen fosfataasin (AP) aktiivisuus sekä hiiren stage-specific embryonic antigen 1 (SSEA-1). Tutkimukset suoritettiin immunovärjäyksinä. Geenimarkkereina käytettiin geenejä Esg1, ERas, Fgf4, Nanog, Zfp42(Rex1), ja ne osoitettiin PCR-menetelmällä. Monikykyisyyttä tutkittiin erilaistamalla solukloonit ja osoittamalla eri alkiokerrokset pintamarkkereiden perusteella. Tämän työn puitteissa tehtiin ektodermin osoitus neuronispesifisellä beta-III-tubuliini-vasta-aineella immunofluoresenssivärjäysmenetelmällä. Tutkimus osoittaa, että molemmat karakterisoidut villityypin kloonit olivat kaikilta tutkituilta ominaisuuksiltaan monikykyisiä kantasoluja. Sen sijaan mutanttiklooneista yksi ei ollut morfologialtaan kantasolumainen, ja toinen osoittautui sekaklooniksi eli solukoloniat olivat vain osin kantasoluja. Kolmas mutanttiklooni ilmensi kantasolugeenimarkkereita heikosti, joten sen osalta PCR-tutkimus tulee suorittaa uudelleen. Kaikki kloonit ilmensivät erilaistumiskykyä ektodermikerroksen soluiksi. Tulosten perusteella molemmat villityypin kloonit ovat hyödynnettävissä jatkotutkimuksessa, ja toinen soveltunee erityisen hyvin neuronitutkimukseen. Mikäli kolmas mutanttiklooni ilmentää PCR-tutkimuksen uusinnassa kantasolugeenimarkkereita, myös se voidaan ottaa jatkotutkimuskäyttöön.

This study was conducted for a National Institute for Health and Welfare (THL) research group that develops cell and mouse models for public health genetics research. The group has generated a new knockout mouse model for the study of proteomics in NCL disorders. The model involves the use of induced pluripotent stem cells (iPS), which are somatic cells genetically reprogrammed to a stem cell-like state by being forced to express cetrain genes, and are capable of generating cells characteristic of all three germ layers. In order to compare the characteristics of the wild type and knock-out mouse, the group needs to demonstrate the differences repeatably in several iPS clones. In this study I characterized two wild type and three knockout iPS cell clones. The purpose of the study was to show whether the clones express embryonal stem cell and pluripotency markers; if this is the case, the clones will be suitable for use in further research. The clones were characterized for morphology as well as the expression of surface and gene markers. Morphology was studied through microscopy, while the presence of surface markers alkaline phosphatase (AP) and mouse stage-specific embryonic antigen 1 (SSEA-1) was determined through immunostaining. PCR analysis was used for gene markers Esg1, ERas, Fgf4, Nanog, Zfp42(Rex1). Pluripotency was tested by differentiating the iPS cell clones and demonstrating the different germ layers through immunofluorescence. In this study, the clones were tested only for the ectoderm through the use of a neuron specific antibody. The results indicated that both of the wild type cell clones expressed all of the tested stem cell and pluripotency markers. Two of the knockout clones, however, expressed unacceptable colony morphology, which in one case was confirmed as a heterogenous population by the SSEA-1 test. The third knockout clone expressed some of the genes only marginally, requiring repeated PCR analysis. All cell clones demonstrated the ability to generate neuronal cells indicative of the ectoderm. The results lead to the conclusions that both wild type iPS clones are suitable for use in continued research, while two out of the three knockout clones are to be discarded. The status of the third knock-out clone is pending a repeated PCR analysis.