Itsemurhavektorin valmistaminen Yersinia enterocolitica O:3:n ligaasigeenin inaktivoimista varten

Abstract

Haartman-instituutissa tutkitaan lipopolysakkaridien merkitystä bakteerien taudinaiheuttamiskyvylle. Tämä opinnäytetyö tehtiin osana tätä tutkimusta. Tavoitteena oli valmistaa waaLos-geenin deleetion sisältävä pSW23T itsemurhavektori, joka siirrettiin Yersinia enterocolitica kantoihin O:3-wt ja Y. enterocolitica O:3-c myöhempää tutkimusta varten.

Yersinia -bakteerit ovat eläinperäisiä elintarvikepatogeenisiä bakteereja. Ne voivat päätyä ruokaan huonon teurastushygienian vuoksi, mutta myös kasvisten osuus bakteerin lähteenä on lisääntynyt. Yersiniat ovat psykrotrofeja, eli ne kykenevät kasvamaan jääkaappiolo-suhteissa. Lisäksi ne kestävät jopa 5 %:n suolapitoisuuksia ja laajaa pH:n vaihtelua. Yleisimmät infektion aiheuttajat ovat Y. enterocolitica tai Y. pseudotuberculosis. Bakteerit aiheuttavat ihmisellä yersinioosin. Yersinioosi on suolistotulehdus, jota voi seurata akuutti niveltulehdus. Yersinioilla on enterobakteerien tapaan ulkokalvon rakenteessa molekyylejä, joita kutsutaan lipopolysakkarideiksi eli LPS:ksi. LPS auttaa bakteeria infektion alkuvaiheessa kätkemään antigeenejä sekä suojautumaan makrofageilta ja erilaisilta antimikrobisilta aineilta. Bakteerin hajotessa LPS hajoaa ja siitä vapautuu endotoksinen rakenneosa, jota kutsutaan lipidi A:ksi. Lipidi A aiheuttaa myrkytysoireita isäntäelimistössä kemiallisten ominaisuuksiensa vuoksi.

Työn ensimmäisenä vaiheena valmistettiin itsemurhavektori pSW23T-waaLos. Geeniä monistettiin PCR-reaktiolla ja se ligoitiin osaksi vektoria, joka transformoitiin Escherichia coli soluihin. Tämän jälkeen geeni katkaistiin PCR-reaktiolla ja geenin väliin liitettiin ligaatiolla tetrasykliiniresistenssigeeni. Plasmidi pSW23T-waaLos::tet transformoitiin ω7249 soluihin, josta inaktivoitu geeni siirrettiin osaksi Y. enterocolitica O:3 wt ja O:3-c solujen genomia. Y. enterocolitica soluista rikastettiin sykloseriinirikastuksella kloramfenikoli herkkiä ja tetra-sykliinille resistenttejä bakteereja.

One research subject in the Haartman institute is the importance of lipopolysaccharides for bacterial virulence. This study was part the research to construct a suicide vector pSW23T with a deletion for gene waaLos inserted in BamHI digestion site. The second aim was to inactivate waaLos the gene of Yersinia enterocolitica O:3 wt and Y. enterocolitica O:3-c strains using the allelic exchange method.

Yersiniae are foodborne pathogens which cause infections in livestock and feral animals. They are psychrotrophic organisms and capable of proliferating in refrigerated conditions. In addition, they are able to endure variation in pH and high salt concentrations up to 5 %. Two of the most common causes of infection in humans are Y. enterocolitica and Y. pseudotuberculosis. These bacteria cause an infectious disease, yersiniosis, which is gastroenteritis which can be followed by reactive arthritis.

Yersiniae have an outer membrane which holds a molecule known as LPS. LPS assist bacteria in the early stages of infection by concealing part of antigens, protecting them from macrophages and protecting them from antimicrobial molecules. Lipopolysaccharide have a subunit in them called lipid-A. This structure has endotoxic effects when it is released from LPS.

The first objective of the study was to construct the plasmid with the waaLos gene ligated as part of it. The gene was amplified using PCR-reaction, which was followed by digestions and ligation into the vector. The ligation mixture was transformed into Escherichia coli cells. The plasmid was isolated from the cells and the gene was interrupted introducing tetracycline resistance gene in the middle of the WaaLos gene. Plasmid pSW23T-waaLos::tet was transformed into ω7249 cells which were used to conjugate with Y. enterocolitica O:3 wt and Y. enterocolitica O:3-c and introduce the deletion as part of genomic DNA via allelic exchange. Bacteria with deletion were selected using cycloserine enrichment. The method employed a process which resulted in colonies sensitive to chloramphenicol and resistant to tetracycline.