Purification of TAP tagged yeast proteins associated with mitochondrial fatty acid synthesis

Abstract

This thesis was done in the research groups of Kalervo Hiltunen and Alexander Kastaniotis at the Oulu University in the Department of Biochemistry. The aim of the study was to purify TAP tagged Rpm2p protein from yeast cell extracts or mitochondrial extracts with IgG columns with a mildly modified procedure in wildtype and the mtFAS deficient etr1Δ strains to asses Rpm2p palmitoylation and physical interactions.

The first purification was made using solubilised extract from 2-3 g of cells and the second using purified mitochondria. Both were then continued in a similar manner by binding the TAP tagged target proteins in IgG columns and then eluting them with self made TEV protease. Finally the proteins were analysed with SDS-PAGE and MALDI-TOF mass spectrometry.

Neither of these purifications worked out for the protein of main interest. Only the self made TEV protease and the Gcv3p protein of the control strain could be identified. Nevertheless, the fact that the Gcv3p could be purified proves that the purification should work in general and this work will provide a good starting point for optimization and further investigations.

Tämä opinnäytetyö tehtiin Kalervo Hiltusen ja Alexander Kastaniotiksen tutkimusryhmissä Oulun yliopiston biokemian laitoksella. Työn tavoitteena oli puhdistaa mitokondriaalinen Rpm2p proteiini TAP-affiniteettikromatografisesti kahta erilaista uutetta käyttäen. Ensimmäinen puhdistus tehtiin uuttamalla proteiinit 2-3 grammasta hiivasoluja ja toinen puhdistus tehtiin puhdistetuista mitokondrioista. Molempia puhdistuksia jatkettiin tästä samalla tavoin sitomalla kohdeproteiinit IgG-kolonniin ja eluoimalla ne itse tuotetulla TEV proteaasilla. Proteiinit analysoitiin vielä SDS-PAGElla ja MALDI-TOF -massaspektrometrillä.

Kumpikaan puhdistusmenetelmistä ei toiminut kohdeproteiinin osalta ja ainoastaan kontrollihiivakannan proteiini Gcv3p sekä itse tuotettu TEV proteaasi saatiin tunnistettua massaspektrometrillä. Koska Gcv3p onnistuttiin kuitenkin puhdistamaan, voidaan päätellä, että puhdistusmenetelmä on kehityskelpoinen. Tämä työ toimiikin hyvänä lähtökohtana puhdistusmenetelmän optimoimiselle ja tuleville tutkimuksille.