Screw-proteiinin proteolyyttisen muokkauksen merkitys banaanikärpäsen alkionkehityksessä

Abstract

Transformoiva kasvutekijä β (Transforming growth factor β, TGF-β) -suurperheen signaalimolekyylit tuotetaan soluissa suurina inaktiivisina esiasteina, joista vain aktiivinen ligandiosa eritetään ulos soluista proteolyyttisen pilkkomisen jälkeen. Näin ollen proteiinien prosessoinnilla on tärkeä rooli TGF-β-signaloinnissa. Decapentaplegic (Dpp) ja Screw (Scw) ovat banaanikärpäsen (Drosophila melanogaster) luun morfogeneettisiä proteiineja (Bone morphogenetic proteins, BMPs) ja kuuluvat TGF-β-suurperheeseen. Dpp ja Scw toimivat heterodimeerinä banaanikärpäsen alkionkehityksen aikana muodostaen morfogeenin tavoin pitoisuusgradientin kehittyvässä kudoksessa. Dpp-proteiinin on todettu olevan välttämätön banaanikärpäsen alkion oikeanlaiselle kehitykselle ja sen taustalla olevia molekyylimekanismeja onkin tutkittu ahkerasti. Kuitenkin Scw-signaloinnin säätelystä tiedetään vähän. Tässä työssä tutkittiin Scw:n proteolyyttista muokkausta ja sen vaikutusta banaanikärpäsen alkionkehitykseen.

Tulokset osoittivat, että Scw-proteiinin esiaste pitää pilkkoa kahdesta eri kohdasta, jotta solusta ulos eritettävä ligandi olisi täysin aktiivinen; furiinin tunnistuskohdasta I (FSI), joka sijaitsee aktiivisen domeenin ja prodomeenin välissä sekä furiinin tunnistuskohdasta II (FSII), joka sijaitsee prodomeenialueella. Mutaatio furiinin tunnistuskohdassa I tai II johti toimivan ligandin tuottoon Drosophilan S2-soluviljelmässä, mutta ligandin eritys soluista oli alhainen. Lisäksi mutaatio furiinin tunnistuskohdassa I johti normaalia suurempikokoisen ligandin tuottoon. Tutkimukset Scw-rekombinanttiproteiinien funktionaalisuudesta in vivo osoittivat, että normaali Scw-proteiini pystyi pelastamaan toimimattoman Scw-geenin omaavan genotyypin, mutta furiinin tunnistuskohdasta I ja II mutatoidut Scw-rekombinanttiproteiinit eivät. Lisäksi mutaatio Scw-proteiinin furiinin tunnistuskohdassa I tai II vaikutti negatiivisesti Dpp-signalointiin. Scw-proteiinin esiasteen proteolyyttinen pilkkominen on siis välttämätöntä banaanikärpäsen oikeanlaiselle alkionkehitykselle.

Saadut tulokset ovat tärkeitä, koska Scw-signaloinnin merkityksestä banaanikärpäsen alkionkehityksessä tiedetään hyvin vähän. BMP-perheen proteiinit ovat myös hyvin konservoituneita eri eläinlajeissa, mikä mahdollistaa tulosten soveltamisen jopa ihmisiin. Työn tulokset on esitetty käsikirjoituksessa, joka lähetetään julkaistavaksi tieteelliseen lehteen.

Signaling molecules belonging to the Transforming growth factor β (TGF-β) superfamily are produced as large inactive precursor forms and secreted as mature ligands after cleavage. Therefore, a proteolytic processing of precursor proteins of TGF-β type ligands plays an important role in their signaling. Decapentaplegic (Dpp) and Screw (Scw) in fruit fly Drosophila melanogaster belong to the family of Bone morphogenetic proteins (BMPs), a subgroup of the TGF-β superfamily. In Drosophila embryo, Dpp and Scw function as a heterodimer to provide an activity gradient as morphogen. Even though molecular mechanisms of Dpp has been intensely studied, little is known about how Scw signaling is precisely regulated during embryogenesis. In this work the significance of Scw processing in Drosophila development has been investigated.

Results showed that Scw precursor needs to be cleaved at two different sites being fully functional: a furin recognition site adjacent to the ligand domain (FSI) and a furin recognition site of the prodomain (FSII). Mutation analysis of cleavage site I suggested that a larger form of functional ligand is produced and secreted in Drosophila S2 cells but the amount of secreted proteins is significantly reduced. Mutation of the prodomain FSII resulted into poor production and secretion of mature ligands. We also tested the in vivo function of Scw cleavages and found that mutant flies with unfunctional Scw-gene were rescued by wild type Scw, but not by its cleavage mutants. Moreover, mutation of FSI and FSII showed dominant negative effect on Dpp-signaling. Taking together, the cleavage of Scw precursor is critical for successful embryogenesis of Drosophila.

The outcome is prominent because it provides more information on the significance of Scw signaling in Drosophila embryogenesis. Furthermore, the proteins belonging to the BMPs are highly conserved between various species that allow applying these findings even to humans. The results of this work will be part of the manuscript that will be sent for publication.