Veren miRNA-profiili keliakiassa

Abstract

Keliakia on tulehduksellinen sairaus, jossa ohutsuolen limakalvon nukkalisäkkeet ma-daltuvat ja kryptat syvenevät. Keliakian aiheuttaa viljan (vehnä, ruis ja ohra) gluteeni. Kaikkia keliakiaan liittyviä ei-geneettisiä riskitekijöitä ei vielä täysin tunneta. Elinikäinen gluteeniton ruokavalio on tällä hetkellä sairauden ainoa hoitokeino. Mikro-RNA:t (miRNA) ovat n. 21 nt pitkiä nukleotidijuosteita, jotka osallistuvat solujen kypsymiseen, erilaistumiseen, apoptoosiin, geeniekspression vaimentamiseen ja geenien toimintaan. Niiden ilmentyminen ja toiminta tulehduksellisissa tautitiloissa tekee niistä tutkimisen arvoisia myös keliakian kannalta. Testattiin neljä (4) erilaista seerumin ja plasman miRNA:n eristämiseen soveltuvaa kittiä parhaan valitsemiseksi jatkotutkimuksiin. Norgenin Total RNA Purification Kit valittiin käyttöön ja sillä eristettiin seerumi- ja plasmapoolit, joissa oli 5-8 näytettä kussakin seuraavasti: Kaksi seerumipoolia terveistä verrokeista, kaksi seerumipoolia akuutin vaiheen keliaakikoilta ja toiset kaksi samoilta vuosi gluteenittoman dieetin aloittamisen jälkeen, neljä plasmapoolia oireettomista ruokavaliohoidetuista keliaakikoista ja toiset neljä samoista potilaista kolmen päivän gluteenialtistuksen jälkeen sekä yksi pooli terveiden verrokkien plasmoista. Mikro-RNA –tasojen mittaamiseen käytettiin kvantitatiivista Real Time PCR hyödyntäviä Exiqonin seerumipaneeleja, jotka analysoitiin Applied Biosystems 7900HT –laitteella. Paneelissa oli 175 erilaista miRNA:ta, joita on löydetty verenkierrosta. Tulosten analyysi suoritettiin GenEx-ohjelmalla. Hepariiniin kerätyt plasmanäyteet jouduttiin hylkäämään tulosten epäluottettavuuden vuoksi ja tulosten tarkastelussa keskityttiin seeruminäytteisiin. Alustavat tulokset osoittivat useiden keliakian riskigeenien säätelyyn liittyvienmiRNA-tasojen laskua ja nousua akuutissa ja hoidetussa keliakiassa. Tulosten varmistamiseksi tehdään uusia tutkimuksia yksittäisillä näytteillä suuremmalla näytemäärällä. Nämä tulokset auttavat ymmärtämään keliakian patogeneesiä ja riskigeenien toimintaa ja merkitystä. Tavoitteena olisi saada aikaan ei-invasiivisia biomarkkerita keliakian ja/tai autoimmuunisairauksien tutkimukseen ja diagnostiikkaan.

Celiac disease (CD) is an inflammatory disease characterised by the flattening of villi and deepening of crypts in the small intestine mucosa. Celiac disease is triggered by gluten, found in grain (wheat, rye and barley). The disease risk is further-more affected by non-genetic factors, all of which are not yet well known. Gluten free diet (gfd) for life time is currently the only treatment for celiac disease. MicroRNAs (miRNAs) are approximately 21 nt long and play a role in eg. cell development, differentiation, apoptosis, gene silencing and function. Their expression and function in various inflammatory processes makes them interesting in the context of celiac disease. Four (4) different miRNA extraction kits were tested to confirm the most efficient method working with plasma and serum samples. After this the Norgen Total RNA Purification Kit was chosen to extract circulating RNA fraction from serum/plasma pools each from 5-8 donors: sera from healthy donors (2 pools), acute untreated celiac disease and the same patients after one year gfd (2 pools), as well as plasma from gfd treated CD patients (2 pools), the same patients after 3 days oral gluten challenge (4 pools) and 1 plasma pool of healthy controls. Quantitative real-time PCR based miRNA serum panel by Exiqon and Applied Biosystems 7900HT platform were used to screen the miRNA-levels in the samples for 175 different miRNAs usually found in circulation. GenEx software was used for analyzing the results. The post-challenge plasma samples had been collected in heparin tubes and were ignored because of the unreliable results; instead we focused only on analysis of the serum samples. The preliminary results suggest several up- or down regulated miRNAs both inactive and healed CD. Many of the miRNAs are predicted to regulate some of the known risk genes of celiac disease. Confirmation of the results will next require replication in larger sample sets and individual, non-pooled samples. The results will help to understand the pathogenesis of celiac disease as well as the function and regulation of the known celiac disease risk genes, and to provide even potential novel non-invasive biomarkers for CD and/or autoimmunity.