Koagulaasipositiivisten stafylokokkien pitoisuusmääritysmenetelmän validointi

Abstract

Opinnäytetyön tavoitteena oli ottaa Valio Oy:n käyttöön vaihtoehtoinen menetelmä, jonka avulla saataisiin tehtyä koagulaasipositiivisten stafylokokkien pitoisuusmääritykset nopeammin ja vähemmällä työajalla verrattaessa käytössä olevaan ISO 6888-1: 1999 -referenssimenetelmään. Samalla arvioitiin saataisiinko alustaa vaihtamalla aikaiseksi säästöjä. Validoinnin suureina olivat menetelmien suhteellinen oikeellisuus, lineaarisuus, täsmällisyys sekä spesifisyys.

Vaihtoehtoisiksi menetelmiksi valittiin Brilliance Staph 24 - sekä ISO 6888-2: 1999 (RPF) -määritysmenetelmät, joita verrattiin käytössä olevaan referenssimenetelmään. Menetelmien tulosten oikeellisuutta tutkittiin meijeriteollisuuden tuotenäytteillä, jotka keinotekoisesti kontaminoitiin Staphylococcus aureus -kannalla kolmella eri pitoisuudella. Lisäksi lineaarisuutta tutkittiin yhdellä matriisilla, viidellä eri pitoisuudella. Menetelmien täsmällisyys ja spesifisyys määritettiin käyttämällä referenssimateriaalia, jonka S. aureus -pitoisuus oli valmistajan toimesta varmennettu 95 %:n luottamustasolla. Menetelmien spesifisyyttä tutkittiin myös siirrostamalla alustoille S. aureus -bakteerin lähisukuisia mikrobikantoja sekä tutkimalla normaalinäytteitä.

Vertailtavien menetelmien keskiarvojen välillä ei havaittu merkittäviä eroja 95 %:n luottamustasolla. Menetelmien korrelaatio referenssimenetelmään oli molemmilla vertailtavilla menetelmillä korkea (r > 0,99). Menetelmien täsmällisyys ja uusittavuus olivat hyväksyttävällä tasolla. Spesifisyyttä tutkittaessa voitiin todeta, että käytössä olevalla Baird-Parker -alustalla kasvoi suuressa osassa näytteitä muuta häiritsevää kasvua kohde-organismin lisäksi. Varmistustestit lisäsivät menetelmän käyttökustannuksia huomattavasti.

Vertailun perusteella Brilliance Staph 24 valittiin käyttöön. Brilliance Staph 24 -alustan voitiin todeta antavan yhtenevät pitoisuustulokset, verrattuna ISO 6888-1: 1999 -menetelmään, mutta se oli erittäin paljon spesifisempi, jolloin varmistustestien määrä oli pienempi.

Brilliance Staph 24 -alusta on tällä hetkellä FINAS-akkreditoitu ja käytössä Valiolla Mikrobiologinen laatu -laboratoriossa ja Lapinlahden aluelaboratoriossa.

This Bachelor’s thesis was carried out for the Laboratory of Microbiology Quality of Valio R&D. The purpose of this thesis was to introduce an alternative method for the enumeration of coagulase-positive staphylococci which gives the final results quicker and is more cost-effective than the current ISO 6888-1: 1999 -reference method. The specifications of the validation were relative accuracy, linearity, precision and specificity.

The alternative methods, which were compared to the reference method, were chosen to be Brilliance Staph 24 and ISO 6888-2: 1999 (RPF) -techniques. The relative accuracy of the methods was studied with dairy products, which were artificially contaminated with three different contamination levels of Staphylococcus aureus -strain. The linearity of the methods was compared with one matrix and five different contamination levels. Certified reference material was used to determine the precision and specificity of the methods. The specificity of the methods was determined by inoculating closely related S. aureus -strains to the compared mediums and by examining normal matrix.

No significant differences were observed between the mean counts obtained in all of the alternative methods. Alternative methods had high (r > 0,99) correlation indices between the reference method. The accuracy and reproducibility of the alternative methods were acceptable level. The specificity of ISO 6888-1: 1999 -reference method gave some overestimations of coagulase-positive staphylococci due to overgrowth with competing flora. This added the need of tube coagulase tests and increased operating expenses of the method.

On the basis of the results of this thesis Brilliance Staph 24 was chosen to be taken into use at Valio. Brilliance Staph 24 showed a good degree of equivalence to the ISO 6888-1: 1999 -reference method for the enumeration of coagulase positive staphylococci. Brilliance Staph 24 was highly more specific compared to the current reference method, which al¬lows lower numbers of confirmation tests.

Brilliance Staph 24 -medium is now FINAS-accredited and in use at Valio in Laboratory of Microbiology Quality and Lapinlahti Regional Laboratory.