Keuhkosyöpään liittyvän EML4-ALK-fuusio-onkogeenin osoittaminen parafiinileikkeestä syväsekvensointimenetelmällä : Tulosten vertaaminen FISH-menetemän avulla saatuihin tuloksiin.

Abstract

Keuhkosyöpä on maailman yleisin syöpä ilmaantuvuuden ja kuolleisuuden suhteen. Sen myöhäisestä diagnosoinnista johtuen hoitoennuste on usein huono, sillä syöpä on levinnyt hoidon ulottumattomiin. Tehokkaampia diagnosointimenetelmiä tutkitaan jatkuvasti. EML4-ALK-fuusiogeeni on yksi ei-pienisoluista adenokarsinooma keuhkosyöpää aiheuttava geenimutaatio, jota vastaan on kehitetty fuusioproteiinin toiminnan estävä lääke, crizotinibi.

Tämä insinöörityö suoritettiin yhteistyössä Helsingin yliopiston Haartman-instituutin sytomolekyyligenetiikan tutkimusryhmän (CMG) ja Suomen molekyylilääketieteen instituutin (FIMM) kanssa keväällä 2012. Työn tarkoituksena oli verrata fluoresenssi in situ hybridisaatiomenetelmällä (FISH) ja syväsekvensoinnilla (NGS) saatujen tuloksien vastaavuutta toisiinsa. Lisäksi tutkittiin, saadaanko syväsekvensoinnilla lisätietoa inversiosta ja fuusiosta syntyneiden geneettisten poikkeavuuksien tunnistamiseen. Lopuksi verrattiin kirjallisuuslähteiden perusteella menetelmien luotettavuutta, nopeutta ja taloudellisuutta kliinisessä tutkimuspalvelussa.

Tutkimusaineistona käytettiin adenokarsinooma keuhkosyöpää sairastavien potilaiden formaliinifiksoituja parafiiniin valettuja syöpäkudosleikkeitä. Potilaan syöpäkudosnäytteestä tehtiin syväsekvensointi ja FISH-tutkimus. FISH-tutkimuksessa lasille kiinnitetylle kudosleikkeelle hybridisoitiin leimattu FISH-koetinseos ja lasit analysoitiin fluoresenssimikroskoopilla. Potilaan EML4-ALK-status selvitettiin solujen fuusiopositiivisuuden perusteella. Syväsekvensointimenetelmä tapahtui FIMM:n toimesta, ja tuloksia tarkasteltiin analysointiohjelmalla osana opinnäytetyötä.

Työn yhteydessä suoritetussa FISH-tutkimuksessa analysoitiin 26 FISH-lasia, joista viisi tulkittiin EML4-ALK-positiivisiksi. Sekvensointiin käytettiin 43 potilaan tutkimusaineistoa. Syväsekvensointimenetelmä osoitti inversion kautta syntyneen EML4-ALK-fuusiogeenin neljällä potilaalla. FISH- ja syväsekvensointimenetelmän tulokset vastasivat toisiaan. Lisäksi syväsekvensointimenetelmällä pystyttiin tunnistamaan geneettisen poikkeavuuden tyyppi toisin kuin FISH-menetelmällä. Syväsekvensointimenetelmä on kuitenkin toistaiseksi FISH-menetelmää hitaampi ja kalliimpi, eikä sovellu vielä kliiniseen tutkimuspalveluun.

Lung cancer is the most common and fatal cancer in the world. The poor prospect of cure results from the late diagnosis of cancer after it has spread out of the reach of treatment. More effective diagnostics and therapies are researched. EML4-ALK fusion gene is one of the gene mutations causing non-small cell adenocarcinoma lung cancer. It has been developed a targeted medicine, crizotinib, which prevents the function of the fusion protein.

This final year project was carried out in collaboration with the Helsinki Universitys Haartman institute’s Cytomolecular Genetics (CMG) research group and the Institute of Molecular Medicine Finland (FIMM) during spring 2012. The purpose of the research was to compare the results from fluorescent in situ hybridization (FISH) and deep sequencing. In addition it was investigated whether deep sequencing gives further information on whether the gene fusion was formed by inversion or deletion. Finally the reliability, speed and feasibility aspects of workflow in clinical diagnostics were compared on the basis of literature reviews.

Formalin-fixed paraffin embedded tumor tissue samples from adenocarcinoma lung cancer patients were used as research material. Both FISH and deep sequencing were performed from the same sample. In FISH-method, the sample was fixed to the slide and hybridizated with labeled FISH-probe mixture. Slides were analyzed with fluorescence microscope, and the EML4-ALK status was determined according to fusion positive cells. Deep sequencing was done by FIMM, and the results were examined as a part of this thesis.

Five of the 26 slides prepared for the thesis project were detected as EML4-ALK-positive. More extensive research material was used in deep sequencing, and the EML4-ALK status of 43 patients was determined. Sequencing revealed four fusion positive cases, and all of them were formed by inversion. The results from FISH method and deep sequencing correlated each other. Moreover, deep sequencing, unlike FISH, was able to identify genetic anomalies. However, deep sequencing is still a more time-consuming and expensive method than FISH; therefore, it is not suitable for clinical research service at the moment.