Parafiiniin valetun syöpäkudoksen käyttökelpoisuus miRNA-ekspressioprofiloinnissa

Abstract

MikroRNA:t (miRNA) ovat yksijuosteisia ja pieniä (18 - 25 nt) RNA-molekyylejä, jotka kuuluvat ei-koodaavan RNA:n ryhmään. MikroRNA:t säätelevät suuren määrän fysiologisia - ja patologisia prosesseja, kuten kehitys- ja syöpäprosesseja. Siten miRNA:t ovat keskeisiä syöpägeenien säätelyssä.

Perinteisesti miRNA-analyysit on tehty tuoreesta tuumorikudosmateriaalista, mutta tuoremateriaalin saanti aiheuttaa monesti ylitsepääsemättömiä esteitä. Patologiassa tuumorikudosmateriaalin formaliinifiksointi ja parafiiniin valaminen (FFPE) on rutiinimenetelmä. FFPE-tuumorikudosmateriaali säilyy myös pidempään kuin tuore-tuumorikudosmateriaali. Näin ollen FFPE-tuumorikudosmateriaalia on saatavilla laajasti ja helposti.

Tämän projektin tavoitteena oli selvittää FFPE-luuydinbiopsia-tuumorikudosnäytteiden vertailukelpoisuus tuore-luuydinaspiraatti-tuumorikudosnäytteisiin nähden suoritettaessa miRNA-ekspressioprofilointia. Tutkimuksessa tehtiin totaali RNA-eristykset samasta potilaasta samanaikaisesti saadusta tuore-tuumorikudosmateriaalista ja FFPE-tuumorikudosmateriaalista; potilaita oli yhteensä 18. Eristetyn totaali RNA:n laatua ja määrää määritettiin nanodrop spektrofotometrin avulla. Totaali RNA:n hajonneisuutta ja miRNA:n osuutta totaali RNA:sta määritettiin Agilent bioanalysaattorin avulla. Nanodrop-spektrofotometrin ja Agilent bioanalysaattorin tuloksiin perustuen sekä FFPE-kudos- että tuore-kudosmateriaalista saatiin miRNA-mikrolevytestiä varten edustavia RNA-näytteitä.

Vertailtavista pareittaisista- ja rinnakkaisista näytteistä tehtiin miRNA-mikrolevytestit Agilentin mikrolevysysteemiä käyttäen. Kaikkien näytteiden mikrolevytestin QC (laatukontrolli) -arvot olivat myös suositusrajojen sisällä.

Molempien näytetyyppien miRNA-ekspressiot määritettiin GeneSpring GX 10.0-ohjelman avulla. FFPE- ja tuorenäytteiden miRNA-ekspressioprofiilit olivat odotetusti erilaisia. Tuorenäytteissä ekspressoitui enemmän miRNA:ta (~90) kuin FFPE-näytteissä. Tämän voi selittää laatueroilla, joita on havaittu näytetyyppien RNA:ssa. Kuitenkin FFPE-näytteiden miRNA-ekspressioprofiili korreloi hyvin tuorenäytteiden ekspressioprofiilin kanssa. Kaikki FFPE-näytteissä (yhtä lukuun ottamatta) ekspressoituvat miRNA:t olivat myös ekspressoituneina tuorenäytteissä. Vain 3 miRNA:ta, jotka ekspressoituivat tuorenäytteissä olivat systemaattisesti poissa FFPE-näytteistä. Duplikaatti- ja triplikaattinäytteet osoittivat, että miRNA-mikrolevytesti myös aiheuttaa pienin määrin hajontaa.

MicroRNAs (miRNA) are single stranded, small (18 - 25 nt) non-coding RNAs. They have a role in various physiological and pathological processes such as cellular proliferation, differentiation and programmed cell death (apoptosis) by negatively regulating gene expression. Many studies have linked miRNAs to various diseases including cancer.

Traditionally, fresh frozen samples are used in miRNA analysis. However, it is not always easy to acquire fresh frozen study material. On the contrary, formalin-fixed and paraffin embedded tissue materials (FFPE) are routinely prepared for pathological diagnosis. As FFPE material can be also archived for long period of time, it is widely and easily available material compared to fresh frozen material.

The aim of the current project is to compare miRNA expression profile of fresh frozen samples to that of FFPE samples. In total 36 samples from 18 patients were used in the study. There was 2 samples for each patient, a fresh frozen and a FFPE sample. In the first part of the study, RNA was extracted from all patient samples and subsequent quality and concentration measurements were determined with nanodrop spectrophotometer. The degree of RNA degradation and amount of miRNA (percentage) was determined with Agilent bioanalyzer. The obtained results were good enough to continue with the miRNA microarray experiment.

The next part of the study focuses on performing Agilent miRNA-microarray experiment on extracted RNA. Quality control metrics (QC) obtained for all samples after feature extraction were within the limits of guidelines.

The last part of the study was to analyse the data and for this purpose Agilent GeneSpring GX 10.0 software was used. miRNA expression profiles of the two sets of samples were different, as expected. The fresh frozen samples expressed more miRNAs (~90) than the FFPE samples. This can be explained by the quality difference seen in the starting RNA. However, miRNA expression profile of FFPE samples correlated well with that of fresh frozen samples. All, except one, the miRNAs expressed in FFPE samples where also expressed in fresh frozen tissue samples. Only 3 miRNAs expressed in fresh samples where systematically missing from FFPE samples. Duplicate and triplicate samples showed that miRNA-microarray test also causes small dispersion.