Patogeenisten vibriobakteerien määrittäminen elintarvikkeista reaaliaikaisella PCR-menetelmällä

Abstract

Tämä opinnäytetyö suoritettiin tullilaboratoriolle, ja sen tavoitteena oli kehittää reaaliaikainen PCR-menetelmä, jolla kyettäisiin tunnistamaan patogeenisia vibriobakteereja elintarvikematriisista. Vibriot ovat gram-negatiivisia muodoltaan suoria tai jyrkästi kaartuvia sau-vabakteereja. Ne ovat motiileja ja useimmat lajikkeet omaavat yksittäisen polaarisen fla-gellan liikkumista varten. Useimmat lajikkeet ovat oksidaasi- ja katalaasipositiivisia, sekä fermentoivat glukoosia tuottamatta kaasua. Tunnetuista lajeista Vibrio cholerae, Vibrio parahemolyticus ja Vibrio vulnificus ovat tunnettuja ihmispatogeenejä.

Työn pohjana käytettiin FDA:n geelipohjaista PCR-menetelmäehdotusta. Kehitettävä me-netelmä oli reaaliaikainen PCR-menetelmä, joten menetelmään jouduttiin tekemään muutoksia alukkeiden ja koettimien suhteen. Uuden menetelmän etu perinteiseen maljausme-netelmään verrattuna on sen nopeus ja korkeampi herkkyys. Menetelmän testaamisessa käytettiin kala-, kasvis- ja liha-matriiseja.

Työtä varten eri Vibrio-bakteerikannoista valittiin patogeeniset Vibrio cholerae, Vibrio parahemolyticus ja Vibrio vulnificus, mutta menetelmä kattaa myös Vibrio mimicuksen, joka kyetään havainnoimaan Vibrio choleraen alukkeilla. Työ jakautui seuraaviin vaiheisiin: Rikastuksen optimointi, DNA-eristys, alukkeiden ja koettimien valinta, PCR-ajo ja PCR-ohjelman optimointi.

Moninaisten ongelmien johdosta menetelmän testausta ei ehditty toistamaan riittävän useita kertoja validointia varten, mutta saatujen tulosten pohjlta menetelmän kehitystä voidaan jatkaa

This thesis project was made for Finnish customs laboratory, to develop a Real time PCR-method for detection of pathogenic Vibrio-bacteria in foodstuffs. Vibrios are gram-negative straight or rigidly curved rod-bacteria. They are motile, most having a single polar flagellum. Most produce oxidase and catalase and ferment glucose without producing gas. Of the known species, Vibrio.cholerae,Vibrio.parahemolyticus and Vibrio.vulnificus are wellreported human pathogens

FDA: s Gel-based PCR-method was used as a foundation for the project. The developed method was a real-time PCR method and changes were required to primers and probes in relation to the gel-based method. The advantage of the new method in comparison to the basic vase methods is its increased speed and accuracy. Matrices used in testing the method were fish, plant and meat.

For the purpose of this project, the pathogenic strains Vibrio cholerae, Vibrio parahemolyticus and Vibrio vulnificus were chosen, but the method also covers Vibrio mimicus due to its similarity with Vibrio cholerae. The project was divided in the following sections: Enrichment, DNA isolation, primer and probe selection, PCR run and program optimization.