Patogeenisten vibriobakteerien määrittäminen elintarvikkeista reaaliaikaisella PCR-menetelmällä
Pantsar, Harri (2012)
Pantsar, Harri
Metropolia Ammattikorkeakoulu
2012
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2012102614674
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2012102614674
Tiivistelmä
Tämä opinnäytetyö suoritettiin tullilaboratoriolle, ja sen tavoitteena oli kehittää reaaliaikainen PCR-menetelmä, jolla kyettäisiin tunnistamaan patogeenisia vibriobakteereja elintarvikematriisista. Vibriot ovat gram-negatiivisia muodoltaan suoria tai jyrkästi kaartuvia sau-vabakteereja. Ne ovat motiileja ja useimmat lajikkeet omaavat yksittäisen polaarisen fla-gellan liikkumista varten. Useimmat lajikkeet ovat oksidaasi- ja katalaasipositiivisia, sekä fermentoivat glukoosia tuottamatta kaasua. Tunnetuista lajeista Vibrio cholerae, Vibrio parahemolyticus ja Vibrio vulnificus ovat tunnettuja ihmispatogeenejä.
Työn pohjana käytettiin FDA:n geelipohjaista PCR-menetelmäehdotusta. Kehitettävä me-netelmä oli reaaliaikainen PCR-menetelmä, joten menetelmään jouduttiin tekemään muutoksia alukkeiden ja koettimien suhteen. Uuden menetelmän etu perinteiseen maljausme-netelmään verrattuna on sen nopeus ja korkeampi herkkyys. Menetelmän testaamisessa käytettiin kala-, kasvis- ja liha-matriiseja.
Työtä varten eri Vibrio-bakteerikannoista valittiin patogeeniset Vibrio cholerae, Vibrio parahemolyticus ja Vibrio vulnificus, mutta menetelmä kattaa myös Vibrio mimicuksen, joka kyetään havainnoimaan Vibrio choleraen alukkeilla. Työ jakautui seuraaviin vaiheisiin: Rikastuksen optimointi, DNA-eristys, alukkeiden ja koettimien valinta, PCR-ajo ja PCR-ohjelman optimointi.
Moninaisten ongelmien johdosta menetelmän testausta ei ehditty toistamaan riittävän useita kertoja validointia varten, mutta saatujen tulosten pohjlta menetelmän kehitystä voidaan jatkaa
Työn pohjana käytettiin FDA:n geelipohjaista PCR-menetelmäehdotusta. Kehitettävä me-netelmä oli reaaliaikainen PCR-menetelmä, joten menetelmään jouduttiin tekemään muutoksia alukkeiden ja koettimien suhteen. Uuden menetelmän etu perinteiseen maljausme-netelmään verrattuna on sen nopeus ja korkeampi herkkyys. Menetelmän testaamisessa käytettiin kala-, kasvis- ja liha-matriiseja.
Työtä varten eri Vibrio-bakteerikannoista valittiin patogeeniset Vibrio cholerae, Vibrio parahemolyticus ja Vibrio vulnificus, mutta menetelmä kattaa myös Vibrio mimicuksen, joka kyetään havainnoimaan Vibrio choleraen alukkeilla. Työ jakautui seuraaviin vaiheisiin: Rikastuksen optimointi, DNA-eristys, alukkeiden ja koettimien valinta, PCR-ajo ja PCR-ohjelman optimointi.
Moninaisten ongelmien johdosta menetelmän testausta ei ehditty toistamaan riittävän useita kertoja validointia varten, mutta saatujen tulosten pohjlta menetelmän kehitystä voidaan jatkaa