Fluoresoivan menetelmän soveltuvuuden tutkiminen eksonukleaasiaktiivisuuden osoittamiseksi proteiinipitoisista näytteistä
Taipale, Mirva (2021)
Taipale, Mirva
2021
All rights reserved. This publication is copyrighted. You may download, display and print it for Your own personal use. Commercial use is prohibited.
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-202103253838
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-202103253838
Tiivistelmä
Opinnäytetyössä tutkittiin, soveltuvatko hiuspinnirakenteiset Molecular Beacon -koettimet eksonukleaasiaktiivisuuden osoittamiseksi näytteistä rekombinanttiproteiinien puhdistusprosessissa sekä laadunvalvonnassa. Tutkimustyö tehtiin Mobidiag Oy:n Espoon toimipisteessä tuotannon yksikössä. Yritys valmistaa PCR-tekniikkaan pohjautuvia diagnostiikkatestejä kliinisen mikrobiologian laboratorioille kansainvälisesti.
Rekombinanttiproteiinin tuottosolut sisältävät paljon erilaisia proteiineja ja DNA:ta, jotka ovat ei-toivottuja epäpuhtauksia lopputuotteessa. Nämä kontaminantit on puhdistettava kohdeproteiinista, polymeraasientsyymistä, onnistuneiden PCR-reaktioiden tuottamiseksi. Eksonukleaasit ovat yksi lopputuotetta kontaminoivista proteiineista. Nämä entsyymit pilkkovat DNA- ja RNA-juosteita niiden vapaista päistä 3’- tai 5’-suuntaisesti. Tutkimuksissa käytettiin kolmea erilaista Molecular Beacon -koetinta, tylppäpäistä, 3’- sekä 5’-häntäistä, joihin oli liitetty fluoroforiksi 6-FAM ja sammuttajamolekyyliksi Iowa Black© FQ. Koettimien oli tarkoitus säilyttää silmukkarakenteensa reaktio-olosuhteissa ja potentiaalinen eksonukleaasiaktiivisuus havaittaisiin fluoresenssin nousuna, mikäli eksonukleaasientsyymit kykenisivät irrottamaan fluoroforin tai sammuttajamolekyylin.
Opinnäytetyössä tutkittiin kaupallisten puskureiden korvaamismahdollisuutta yhdellä puskurilla, Taq-puskurilla. Koetinseoksen käyttökonsentraatiota arvioitiin titrauksen avulla. Taq-polymeraasin 5’-eksonukleaasiaktiivisuuden osoittamista reaktioista tutkittiin yksittäisillä koettimilla sekä näiden seoksena. Lisäksi analysoitiin Escherichia coli -bakteerin solulysaatin vaikutusta tuloksiin sellaisenaan ja ioninvaihtokromatografian avulla tuotettuina eksonukleaasipitoisina fraktioina. Tuotetut fraktiot analysoitiin myös radioaktiivisella menetelmällä yrityksen työohjeen mukaisesti.
Tutkimustulosten perusteella reaktiot oli mahdollista tuottaa onnistuneesti kaikissa käytetyissä puskureissa. Taq-polymeraasin 5’-eksonukleaasiaktiivisuus oli mahdollista osoittaa puhtaammista näytteistä, jotka eivät sisältäneet paljon eksonukleaasiaktiivisuutta. Sekä tutkitulla fluoresoivalla menetelmällä että yrityksessä käytössä olleella radioaktiivisella menetelmällä saatiin samankaltaiset eksonukleaasiprofiilit kromatografian avulla tuotetuille eluutiofraktioille. Tämän opinnäytetyön tuloksia tullaan hyödyntämään fluoresoivan menetelmän käyttöönottoa varten tehtävissä tutkimuksissa, joita tullaan käsittelemään toisen opinnäytetyön aiheena.
Rekombinanttiproteiinin tuottosolut sisältävät paljon erilaisia proteiineja ja DNA:ta, jotka ovat ei-toivottuja epäpuhtauksia lopputuotteessa. Nämä kontaminantit on puhdistettava kohdeproteiinista, polymeraasientsyymistä, onnistuneiden PCR-reaktioiden tuottamiseksi. Eksonukleaasit ovat yksi lopputuotetta kontaminoivista proteiineista. Nämä entsyymit pilkkovat DNA- ja RNA-juosteita niiden vapaista päistä 3’- tai 5’-suuntaisesti. Tutkimuksissa käytettiin kolmea erilaista Molecular Beacon -koetinta, tylppäpäistä, 3’- sekä 5’-häntäistä, joihin oli liitetty fluoroforiksi 6-FAM ja sammuttajamolekyyliksi Iowa Black© FQ. Koettimien oli tarkoitus säilyttää silmukkarakenteensa reaktio-olosuhteissa ja potentiaalinen eksonukleaasiaktiivisuus havaittaisiin fluoresenssin nousuna, mikäli eksonukleaasientsyymit kykenisivät irrottamaan fluoroforin tai sammuttajamolekyylin.
Opinnäytetyössä tutkittiin kaupallisten puskureiden korvaamismahdollisuutta yhdellä puskurilla, Taq-puskurilla. Koetinseoksen käyttökonsentraatiota arvioitiin titrauksen avulla. Taq-polymeraasin 5’-eksonukleaasiaktiivisuuden osoittamista reaktioista tutkittiin yksittäisillä koettimilla sekä näiden seoksena. Lisäksi analysoitiin Escherichia coli -bakteerin solulysaatin vaikutusta tuloksiin sellaisenaan ja ioninvaihtokromatografian avulla tuotettuina eksonukleaasipitoisina fraktioina. Tuotetut fraktiot analysoitiin myös radioaktiivisella menetelmällä yrityksen työohjeen mukaisesti.
Tutkimustulosten perusteella reaktiot oli mahdollista tuottaa onnistuneesti kaikissa käytetyissä puskureissa. Taq-polymeraasin 5’-eksonukleaasiaktiivisuus oli mahdollista osoittaa puhtaammista näytteistä, jotka eivät sisältäneet paljon eksonukleaasiaktiivisuutta. Sekä tutkitulla fluoresoivalla menetelmällä että yrityksessä käytössä olleella radioaktiivisella menetelmällä saatiin samankaltaiset eksonukleaasiprofiilit kromatografian avulla tuotetuille eluutiofraktioille. Tämän opinnäytetyön tuloksia tullaan hyödyntämään fluoresoivan menetelmän käyttöönottoa varten tehtävissä tutkimuksissa, joita tullaan käsittelemään toisen opinnäytetyön aiheena.