E-kadheriinin ilmentymisen havainnointi eukaryoottisoluissa fluoresoivan reportterin avulla

Abstract

Opinnäytetyömme aiheena oli havainnoida ja havainnollistaa eukaryoottisolujen muuntumista mesenkymaalisen solulinjan solusta epiteelisoluksi. Havainnoimme epiteelisoluille tyypillisen pintaproteiinin, E-kadheriinin, ilmentymistä eri kehitysvaiheissa olevien solulinjojen immunovärjäyksillä. Lisäksi tutkimme, voiko solujen muuntumisprosessia solutyypistä toiseksi havaita viemällä soluun sisälle E-kadheriinin promoottorilla toimiva reportterigeeni. Tutkimme myös, miten eri indusoivat aineet vaikuttivat E-kadheriinin ekspressioon solukalvon pinnalla.

Tutkimuksen taustalla oli tarve kehittää menetelmä, jolla voitaisiin seuloa potentiaalisia munuaisen kehitykseen vaikuttavia transkriptiotekijöitä. Nykyisin käytössä oleviin menetelmiin kuuluu mahdollisten transkriptiotekijöiden tutkiminen hiirimalleilla, joka tutkimuksena kestää pitkään ja on kallista. Solumalli, joka pystyisi reportterigeenin avulla kertomaan solutyypin muuttumisesta mesenkymaalisesta epiteeliksi, nopeuttaisi huomattavasti olemassa olevaa tutkimusta.

Kokeilemistamme vektoreista yksi osoittautui hieman muita toimivammaksi E-kadheriiniekspression ilmentäjäksi. Lisäksi havaitsimme, että käyttämämme MK3- ja MK4-solulinjat eivät ilmentäneet E-kadheriinia odotetusti ja että ekspressio lisääntyy induktorien vaikutuksesta. Saamiemme tulosten pohjalta tutkimusryhmä saattoi edetä suunnittelemaan vektoreilla tehtävää pysyvää transfektioktiota, minkä tarkoituksena on pystyä lopulta tekemään seulontatestejä transkriptiofaktoreille.

The basis for our study was the demand to construct more efficient techniques for identifying the potential transcription factors that participate in the renal development. Currently used methods include mouse models which tend to be expensive, time consuming and ethically problematic. Thus a cell model that could visualize the transition of mesenchymal to epithelial could speed up the research on renal development.

The aim of our thesis was to observe and visualize the mesenchymal-epithelial transition in eukaryotic cell lines. We observed the expression of epithelial specific protein E-cadherin by immunostaining of cell lines in different stages of development. In addition we examined whether a fluorescent reporter could be used to visualize the transition process. We also examined how the E-cadherin expression would be affected by cell inducing substances.

One vector tested seemed to have slightly more potential to be used for the visualization of E-cadherin expression and therefore also for the visualization of mesenchymal-epithelial transition. Furthermore, we found out that the MK3 and MK4 cell lines did not express E-cadherin as expected and yet inducing substances increase the level of E-cadherin expression. Results encouraged the research group to go on with this approach and to perform stable transfections for cell lines in order to develop a cell line for various transcription factor screening tests.