Enterococcus faecalis ja Enterococcus faecium - spesifisten faagien eristys faagihoitokäyttöön

Abstract

Opinnäytetyö toteutettiin yhteistyössä Helsingin yliopiston tutkimusohjelmayksikkö Ihmisen mikrobit -tutkimusryhmään kuuluvan Faagihoitoryhmän kanssa. Tavoitteena oli laajentaa tutkimusryhmän bakteriofagikokoelmaa eristämällä uusia Enterococcus faecalis ja Enterococcus faecium bakteereille spesifisiä bakteriofageja faagihoito tarkoitukseen. Faagihoidossa hyödynnetään bakteerien viruksia, bakteriofageja, antibioottiresistenttien bakteereiden aiheuttamien infektioiden hoidossa. Faagihoito perustuu bakteriofagien kykyyn infektoida niiden isäntäbakteeri ja näin hävittää infektio. Antibioottiresistentit bakteerit ja niiden aiheuttamat infektiot aiheuttavat ongelmia maailmanlaajuisesti. Yhä useammalla bakteerilla on luontaista sekä hankittua resistenssiä antibiootteja kohtaan, resistenssi on voinut muodostua useille yleisesti käytössä oleville antibiooteille. Antibioottiresistentit infektiot lisäävät kuolleisuutta ja pitkittävät sairaalahoitojaksoja, josta koituu taloudellisia kustannuksia niin potilaille, kuin terveydenhuollolle maailmanlaajuisesti. Tämän vuoksi on kehitettävä vaihtoehtoisia hoitomuotoja, sillä uusien antibioottien kehittämien on hidasta.

Työ toteutettiin eristämällä uusia bakteriofageja sekä Suomesta, että Beninistä kerätyistä jätevesinäytteistä. E. faecalis ja E. faecium bakteereista valittiin yhteensä 18 bakteerikantaa, joille spesifisiä bakteriofageja tutkimusryhmän bakteriofagi kokoelmasta löytyi vähän tai ei ollenkaan. Jätevesinäytteistä muodostettiin näyteseokset, jotka rikastettiin valittujen bakteerikantojen kanssa. Rikastetut näytteet titrattiin maljoille, joilta tarkasteltiin, löytyikö näyteseoksista faageja. Plakkipuhdistus suoritettiin löydetyille faageille ja niistä tuotettiin faagilysaatti. Lysaatista eristettiin faagin DNA:ta sekvensointia varten ja kustakin DNA eristysnäytteestä mitattiin DNA konsentraatio. Näytteistä ajettiin myös agaroosigeeli, jonka avulla tarkasteltiin, onko DNA ehjää, jolloin se voitiin lähettää sekvensoitavaksi. Lopuksi kukin eristetty bakteriofagi karakterisoitiin kartoittamalla niiden isäntäkirjo.

Työn tuloksena tutkimusryhmän kokoelmaan eristettiin seitsemän uutta bakteriofagia, joista neljän näytteen DNA eristysnäytteen konsentraatio oli tarpeeksi korkea sekvensointia varten. Karakterisoinnin tuloksena todettiin jokaisen faagin infektoivan oman eristysisäntänsä lisäksi kahta muuta kartoitukseen mukaan otettua E. faecalis tai E. faecium bakteerikantaa.

Lopputuloksena voidaan todeta, että E. faecalis sekä E. faecium kannoille bakteriofageja on haastava löytää. Etenkin E. faecium kantojen resistenssi on viime vuosina ollut nousussa, joka luo painetta uusien hoitomuotojen kehittämiseen antibioottien kehittämisen ollessa hidasta. Tämä korostaa myös faagihoitoon liittyvän tutkimuksen ja sen kehittämisen tärkeyttä.

The thesis was carried out in the phage therapy research group. This research group is a part of the Human Microbiome Research Program which belongs to Research Programs Unit of University of Helsinki. The aim of this study was to expand the group’s phage collection by isolating new Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium -specific bacteriophages. Phage therapy can be used to treat infections caused by antibiotic resistance bacteria. Antibiotic resistance has become a major problem worldwide as increasing number of bacteria have natural as well as acquired resistance to antibiotics. Infections caused by resistant bacteria increases mortality, prolong hospital stays as the infections can be hard to treat and add financial costs to both patients and healthcare. As research of developing new antibiotics can be slow, there is a need for alternative therapies alongside antibiotics. Phage therapy is based on using bacterial viruses, bacteriophages, to infect and eliminate their host bacteria and thereby cure the infection.

The aim was to isolate phages from wastewater samples collected from both Finland and Benin. A total of 18 E. faecalis and E. faecium strains were selected for this project, all which had only few or no specific phages in existing phage collection. Wastewater samples were pooled to different mixtures and were then enriched together with selected bacterial strains. Plaque purification was done, and lysate produced on the phages found. Isolation of phage DNA was done for sequencing purposes. Before sending isolated DNA samples for sequencing, they were run on an agarose gel to examine that the DNA was not fragmented. Finally, each isolated phage was characterized by screening their bacterial host range.

In total, seven new phages were isolated from Finnish wastewater samples. Four of them had DNA concentration high enough for them to be send for sequencing. As a result of characterization, each isolated phage was found to infect two E. faecalis or E. faecium strains that were included in screening. This was in addition to their own host bacteria.

In conclusion, phages for E. faecalis and E. faecium strains can be challenging to find and isolate. Especially the resistance of E. faecium strains has been rising in the last years as well as antibiotic resistance in general. It has been putting pressure to research alternative treatment options, like phage therapy, since development of new antibiotics is slow. This highlights the importance of continuing research of phage therapy and develop it further as a treatment option.