Nopean PCR-ohjelman soveltuvuus sytomegaloviruksen nukleiinihapon määritykseen : DyNAmo™ Flash Probe qPCR ja QuantiFast™ Probe PCR -reagenssien sekä PCR-ohjelmien vertailu
Kortelainen, Veera; Kola, Hanna (2009)
Metropolia Ammattikorkeakoulu
2009
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-200912016693
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-200912016693
Tiivistelmä
Sytomegalovirus (CMV) on yleinen herpesviruksiin kuuluva taudinaiheuttaja. Se voi aiheuttaa immuunipuutospotilailla, kuten elinsiirtopotilailla, vaikeita infektioita. Yleisin CMV:n diagnosointiin ja hoidon seurantaan käytetty tutkimus on viruksen nukleiinihapon määritys. Se tehdään kvantitatiivisella reaaliaikaisella PCR -menetelmällä. Viime aikoina markkinoille on tullut uusia nopeampia reagensseja menetelmää varten, nk. fastmixejä.
Opinnäytetyö tehtiin HUSLABin virologian osastolle. Työn tarkoituksena oli selvittää, sopiiko Finnzymesin DyNAmo Flash Probe Master Mix tai Qiagenen QuantiFast Probe PCR Master Mix CMV:n nukleiinihapon määrittämiseen lyhyellä PCR-ohjelmalla. Mastermixeistä tutkittiin niiden inhibitionsietoa, herkkyyttä, toimivuutta pakastetuilla templaateilla ja tulosten korrelaatiota Applied Biosystemsin TaqMan Universal PCR Master Mix -reaktioliuoksella saatuihin tuloksiin. Paremmalta vaikuttanut fastmix otettiin mukaan jatkotestaukseen. Nukleiinihapon eristykseen käytettiin Magna Pure LC -laitetta ja PCR-mittauksiin Stratagenen MX3005P-analysaattoria. Jatkotestauksessa määritimme 91 potilasnäytettä ja kaksi toistonäytettä sekä lyhyellä että normaalilla PCR-ohjelmalla.
Fastmixit olivat herkkiä ja sietivät hyvin inhibiittoreita. Pakastetuilla templaateilla saadut tulokset olivat ristiriitaiset. Finnzymesin DyNAmo Flash Probe Master Mix:llä oli parempi kvantitaation korrelaatio ja yhteneväisempi tulostaso TaqMan Universal PCR Master Mix:n kanssa kuin Qiagenen QuantiFast Probe PCR Master Mix:llä. Valitsimme jatkomittauksiin Finnzymesin reagenssin. Jatkomittauksissa Finnzymesin lyhyellä PCR-ajolla ja Applied Biosystemsin normaalilla PCR-ajolla saatujen tulosten korrelaatio oli 0,629. Regressiosuoran kulmakerroin oli 0,76, y-akselin leikkauspiste 24 294 ja selitysaste 0,40. Toistonäytteiden tulosten keskihajonta oli Finnzymesin reagenssilla paljon suurempi kuin Applied Biosystemsin reagenssilla.
Tulokset osoittavat, ettei Finnzymesin DyNAmo Flash Probe -reaktioliuos sovellu virologian osastolla CMV:n nukleiinihapon määrittämiseen. Korrelaatio Applied Biosystemsin TaqMan Universal PCR reaktioliuoksen kanssa ei ollut hyvä. Tuloksissa oli paljon hajontaa ja tulostaso oli selvästi korkeampi.
Opinnäytetyö tehtiin HUSLABin virologian osastolle. Työn tarkoituksena oli selvittää, sopiiko Finnzymesin DyNAmo Flash Probe Master Mix tai Qiagenen QuantiFast Probe PCR Master Mix CMV:n nukleiinihapon määrittämiseen lyhyellä PCR-ohjelmalla. Mastermixeistä tutkittiin niiden inhibitionsietoa, herkkyyttä, toimivuutta pakastetuilla templaateilla ja tulosten korrelaatiota Applied Biosystemsin TaqMan Universal PCR Master Mix -reaktioliuoksella saatuihin tuloksiin. Paremmalta vaikuttanut fastmix otettiin mukaan jatkotestaukseen. Nukleiinihapon eristykseen käytettiin Magna Pure LC -laitetta ja PCR-mittauksiin Stratagenen MX3005P-analysaattoria. Jatkotestauksessa määritimme 91 potilasnäytettä ja kaksi toistonäytettä sekä lyhyellä että normaalilla PCR-ohjelmalla.
Fastmixit olivat herkkiä ja sietivät hyvin inhibiittoreita. Pakastetuilla templaateilla saadut tulokset olivat ristiriitaiset. Finnzymesin DyNAmo Flash Probe Master Mix:llä oli parempi kvantitaation korrelaatio ja yhteneväisempi tulostaso TaqMan Universal PCR Master Mix:n kanssa kuin Qiagenen QuantiFast Probe PCR Master Mix:llä. Valitsimme jatkomittauksiin Finnzymesin reagenssin. Jatkomittauksissa Finnzymesin lyhyellä PCR-ajolla ja Applied Biosystemsin normaalilla PCR-ajolla saatujen tulosten korrelaatio oli 0,629. Regressiosuoran kulmakerroin oli 0,76, y-akselin leikkauspiste 24 294 ja selitysaste 0,40. Toistonäytteiden tulosten keskihajonta oli Finnzymesin reagenssilla paljon suurempi kuin Applied Biosystemsin reagenssilla.
Tulokset osoittavat, ettei Finnzymesin DyNAmo Flash Probe -reaktioliuos sovellu virologian osastolla CMV:n nukleiinihapon määrittämiseen. Korrelaatio Applied Biosystemsin TaqMan Universal PCR reaktioliuoksen kanssa ei ollut hyvä. Tuloksissa oli paljon hajontaa ja tulostaso oli selvästi korkeampi.