Komplementin klassisen tien, lektiinitien ja oikotien aktiivisuuden säilyvyys seerumissa

Abstract

Olen tehnyt opinnäytetyöni HUSLABiin kuuluvan immunologian yksikön toimenannosta. Työni tarkoitus oli tutkia, kuinka komplementtipuutosnäytteeseen (S-C-DEF) kuuluvien klassisen tien, lektiinitien ja oikotien aktiivisuudet seerumissa muuttuvat erilaisissa lämpötilaolosuhteissa säilytettyinä. Tutkin myös seerumigeeliputken soveltuvuutta komplementtinäytteen säilytykseen. Aikaisempaa tutkimustietoa aiheestani ei ole, jonka takia työni HUSLABissa koettiin tarpeelliseksi. Otin verinäytteet kymmeneltä (n=10) terveeltä koehenkilöltä. Poikkeuksena oli, että yhdellä koehenkilöistä oli synnynnäinen lektiinitiepuutos. Kunkin koehenkilön verinäytteistä jaettiin yhdeksän seeruminäytettä, joita säilytin kohtien A, B, C, D, E, F, G, H ja I mukaisesti. Selvitin, kuinka komplementtiaktiivisuus säilyy eri tapauksissa. Verinäytteiden A, B, C, D annettiin seistä tunti ennen sentrifugointia, jonka jälkeen seerumit jaettiin ja A pakastettiin suoraan -20 °C, B säilytettiin +4 °C vuorokausi, C säilytettiin huoneenlämmössä vuorokausi ja D säilytettiin kolme vuorokautta +4 °C. Näytteet E, F seisoivat kaksi tuntia ennen sent-rifugointia, jonka jälkeen seerumit jaettiin ja E pakastettiin -20 °C ja F säilytettiin kolme vuorokautta +4 °C. Tutkin myös, kuinka komplementtiaktiivisuus säilyy +37 °C olosuhteissa, kun seerumi seisoi tunnin ennen sentrifugointia ja heti sentrifugoinnin jälkeen jaettiin ja G pakastettiin -20 °C ja H pakastettiin -20 °C, annettiin sulaa tunti huoneenlämmössä ja pakastettiin uudelleen. Kohdassa I selvitin komplementtiaktiivisuuden säilyvyyttä seerumi-geeliputkessa HUSLABin normaalin käytännön mukaisesti (kohta A). Lopuksi pakastin kaikki näytesarjat -20 °C. Suoritin näytteiden analyysin Wieslab®-entsyymi-immunologisella menetelmällä käyttäen Labsystems iEMS Reader MF-fotometria. Tulosteni mukaan klassisen tien, lektiinitien ja oikotien komplementtiaktiivisuus säilyy seerumissa hyvin kaikissa tutkimissani olosuhteissa. Näytesarja A on HUSLAB:n ohjeen mukaisesti käsitelty, jonka tuloksiin vertasin muita näytesarjoja. Ainoastaan klassisessa tiessä näytesarja C säilyy huonosti verrattuna normaaliin käytäntöön. Yksittäisiä epäonnistuneita tuloksia esiintyy lähes jokaisessa näytesarjassa. Mikäli HUSLAB aikoo lisätä komplementtitutkimuksen (S-C-DEF) preanalyyttisiin ohjeisiin jonkin tutkimani säilytysmenetelmän, kannattaa siitä tämän vuoksi tehdä uusi koesarja rinnakkaisnäytteitä käyttäen.

The purpose of this study was to find out how the classical, MBL and alternative pathways of complement in sera were activated in complement deficiency sample (S-C-DEF) when stored at different temperatures. I also studied if the gel tube was suitable for complement samples. There was no previous research into this subject, and therefore, HUSLAB, Helsinki, Finland, wanted me to perform this study. As for methods, I took blood samples on ten (n=10) healthy subjects with the exception that one subject had MBL deficiency. The blood samples were divided into nine sera samples that were stored according to cases A, B, C, D, E, F, G, H and I. I studied how com-plement activity was preserved in each case. Blood samples A, B, C, D allowed to rest for one hour before centrifugation, after which they were divided into sera samples. A samples were directly frozen at -20°C. B samples were stored at +4°C for one night. C samples were stored at room temperature for one night. D samples were stored for three nights at +4°C. Samples E and F were allowed to rest for two hours before centrifugation, after which they were divided into sera samples. E samples were directly frozen at -20°C. F samples were stored for three nights at +4°C. Samples G and H were stored at +37°C for one hour, then centrifuged at +37°C and divided into sera samples. G samples were directly frozen at -20°C. H samples were frozen at -20°C, allowed to melt at room temperature for one hour and then re-frozen. I samples were taken into gel tubes, allowed to rest for one hour before centrifugation, when frozen at -20°C. In the end, all samples were frozen at -20°C. The samples were analysed with the Wieslab® enzyme immunoassay technique using the Labsystems iEMS Reader MF photometry. According to my results, complement activity was preserved well in almost all of the studied conditions. The A samples were stored according to the HUSLAB’s instructions. The results of other samples were compared to the A sample results. Only the C samples in classical pathway were preserved poorly compared to A sample. There were singular poorly preserved samples in almost every sample series. If HUSLAB wants to use one of these storing methods into their S-C-DEF pre-analytical instructions, another test series should be performed using parallel samples.