RNA-eristysmenetelmien vertailu formaliini-fiksoiduilla parafiiniin valetuilla näytteillä

Abstract

Opinnäytteeni tarkoituksena oli vertailla kolme erilaista RNA:n eristysmenetelmää formaliinifiksoiduilla parafiiniin valetuilla (FFPE) näytteillä. Näytteet olivat peräisin leiomyosar-koomasta (sileän lihaskudoksen pahanlaatuinen kasvain) ja gastrointestinaalinen strooma-tuumori taudista (GIST, maha-suolikanavan harvinainen kasvain). Opinnäytteeni liittyi aka-temiaprofessori Heikki Joensuun johtamaan syöpätutkimusryhmän työhön ja toteutin työni Biomedicumissa Molekyylionkologian laboratoriossa. Työssäni vertasin nykyisin käytössä olevaa RNA:n eristysmenetelmää (High Pure RNA Paraffin Kit, Roche) kahteen uuteen menetelmään. Ensimmäinen menetelmä oli modifikaatio nykyisin käytössä olevasta menetelmästä parafiinin poiston suhteen. Parafiinin poistoon käytin Depafaffinization Solution -liuosta (Qiagen). Toinen menetelmä oli täysin automatisoitu Tissue Preparation System -laite (Siemens) ja siinä käytettiin VERSANT® Tissue Preparation Reagent Kit -menetelmää. Eri menetelmillä saatua RNA:n pitoisuutta tutkin UV-VIS spektrofotometrisesti ja RNA:n laatua reaaliaikaisella käänteistranskriptio PCR:llä. Tuloksista kävi ilmi, että nykyisin käytössä oleva Rochen reagenssisarja on opinnäytteessä verratuista menetelmistä parhain. Qiagenin parafiininpoistoliuoksen käyttö ei tuonut huo-mattavaa lisähyötyä. Näiden kahden menetelmän välillä ei ollut merkitsevää eroavuutta (p-arvo 0,604) ja näytteiden välillä oli voimakas riippuvuus (korrelaatiokerroin 0,982). Sie-mensin automaatin tuottama RNA oli vertailun heikkolaatuisinta. Rochen ja Siemensin menetelmien eroavuus on melkein merkitsevä (p-arvo 0,023) ja niiden välillä oli kohtalainen riippuvuus (korrelaatiokerroin 0,556). Ottaen huomioon työni tulokset tutkimusryhmän kannattaa jatkaa Rochen menetelmän käyttöä. Suosittelen kuitenkin lämpimästi tutustumaan muihin tarjolla oleviin automaattisiin eristysmenetelmiin, sillä niistä saatava hyöty on ylivoimainen manuaalisiin menetelmiin nähden. Automaattisilla menetelmillä voidaan ajaa suurempia näytesarjoja kerralla, työn nopeus on ylivoimainen ja eristys ei sido työntekijää, vaan aikaa vapautuu muuhun työn tekemiseen.

In my study, I compared three different methods of isolating RNA using formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) samples. The samples were from leiomyosarcoma (smooth muscle connective tissue tumor) and gastrointestinal stromal tumor. My study was connected to the work of the cancer research group lead by professor Heikki Joensuu. I performed the study at the molecular oncology laboratory in Biomedicum in Helsinki, Finland. I compared the currently used RNA isolation method (High Pure RNA Paraffin Kit, Roche) with two new methods. One of the new methods was a modification of the current method in regard to the removal of paraffin, in which I used Deparaffinization Solution (Qiagen). The other new method was a fully automated Tissue Preparation System device(Siemens), using VERSANT® Tissue Preparation Reagent Kit. For comparing the results of these three methods, I used UV-VIS spectrophotometer for the concentration and purity of RNA, and real-time reverse transcription PCR for the quality of RNA. The comparison showed that the High Pure RNA Paraffin Kit by Roche, which is currently in use, gave the best results. Using the Deparaffinization Solution by Qiagen did not yield significant improvements, although the results were very similar. What I found surprising was that the automated system by Siemens produced the lowest-quality RNA of the three methods. Therefore, I suggest that the cancer research group should continue using the kit by Roche for isolating RNA